杂交兰(hybrid Cymbidium)是采用国兰与大花蕙兰杂交培育而成的兰花新品种,集大花蕙兰的花大、色艳、花期长和国兰的清香、典雅为一体,具有很高的观赏价值、经济价值和广阔的市场前景。近年来,有关兰属兰花的遗传转化已有一些研究报道,但对杂交兰遗传转化的研究报道较少。本研究以‘小凤兰’根状茎和‘君红兰’类原球茎为材料,研究了影响‘小凤兰’根状茎和‘君红兰’类原球茎遗传转化效率的因素,建立了杂交兰遗传转化体系。主要研究结果如下:1‘君红兰’遗传转化受体系统的构建切割处理对‘君红兰’茎尖类原球茎的诱导影响不显著;培养基对类原球茎增殖和芽苗分化影响显著,最佳增殖和芽苗分化培养基分别为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2 mg/L+AC 0.3 g/L和MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+AC 0.1g/L,其增殖倍数为3.3,芽苗分化率为83.3%,苗高大于或等于3 cm的平均芽苗率为56.7%;生根壮苗培养基对苗高影响显著,对平均叶片数和根数影响不显著,将高4 cm左右的苗接到1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+AC 0.5 g/L培养基中培养60 d,试管苗平均苗高为7.1 cm、叶片数为3.7片/株,根数为3.8条/株;将苗高7 cm左右的试管苗炼苗7 d后移栽到细树皮和泥炭土(2﹕1)的混合基质中,120 d的存活率为96.1%。‘君红兰’类原球茎褐化死亡率随潮霉素浓度的增加而增加,且类原球茎直径越小,对潮霉素反应越敏感。直径为0.3 cm和0.6 cm的类原球茎在潮霉素浓度分别为90 mg/L和110 mg/L时,其一代褐化死亡率分别为51.1%和50%,二代褐化死亡率均为100%。而直径为0.3 cm的类原球茎在潮霉素浓度为50 mg/L时,其一代褐化死亡率为49.9%,二代褐化死亡率为72.2%。因此,本试验确定用于转化体筛选的潮霉素浓度为50 mg/L。头孢霉素对农杆菌的生长有明显的抑制作用,在头孢霉素浓度为200 mg/L的时候,农杆菌的生长受到完全抑制。因此,抑制根癌农杆菌EHA101生长的Cef浓度为200 mg/L。2影响‘君红兰’遗传转化的因素工程菌液浓度和共培养天数对‘君红兰’类原球茎的遗传转化效率影响显著,工程菌液浓度OD600为0.2,‘君红兰’类原球茎的存活率和GUS瞬时表达率最高,分别为66.3%和53.3%。共培养时间为3 d时,‘君红兰’类原球茎的存活率和GUS瞬时表达率最高,分别为60.2%和30.5%。3‘小凤兰’的遗传转化工程菌液浓度和侵染时间对’小凤兰’根状茎的遗传转化效率有明显影响,工程菌液浓度OD600为0.8,侵染时间40 min,根状茎的存活率最高,为14.9%。将不带茎尖、长0.3 cm根状茎在OD600为0.8的工程菌液侵染40 min后共培养10 d,在检测的162株再生植株中,42株为转化植株,转化率为25.9%。通过上述研究,建立了‘君红兰’和‘小凤兰’的农杆菌介导的遗传转化技术体系,获得了42株小凤兰转化植株,为进一步研究At DREB1A基因功能和采用转基因育种方法培育杂交兰新品种奠定了基础。