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癫痫是神经系统疾病中最为常见疾病之一,全球患者超过5000万,几乎涉及到临床的所有学科,尽管人类认识癫痫已有数千年,但并没有完全控制住这种疾病的发作,各种癫痫治疗选择也没有明显改善癫痫的发生率和治愈率,因而从新的领域寻找新的抗癫痫策略迫在眉睫。Ubc9是一个分子量18kd的小分子蛋白,在大脑皮质和海马中广泛表达。Ubc9作为苏化修饰中唯一的一个E2酶,介导了许多蛋白质的苏化修饰,在细胞分裂,转录活性,DNA修复,氧化应激,炎症反应,神经保护,突触可塑性等方面具有重要作用。Ubc9的分布部位和功能研究与癫痫的好发部位和发生机制关系密切,为癫痫发生机制的探讨提供了一种新的视觉,从而有希望成为与传统抗癫痫药物不同的研发靶点。研究目的:本团队已经对ubc9在癫痫动物模型及癫痫患者脑组织标本中的表达以及对癫痫行为学进行了前期研究,在此基础上,本课题将进一步探讨ubc9对癫痫电生理的影响及其在癫痫中的作用机制。从更现实的层次上,通过调控ubc9的功能,可能有助于新的抗癫痫药物的研发提供实验室依据,改变目前临床上癫痫治疗瓶颈。研究方法:本研究分为三部分:1.将健康的C57小鼠随机分为对照组(假手术组),siRNA-ubc9抑制组及Ctrl.siRNA空病毒组,AAV-ubc9过表达组及Ctrl.AAV空病毒组。干预组在造模前一周(抑制组及空病毒组)或两周(过表达组及空病毒组)注射病毒,建立海人酸癫痫小鼠模型,每组均取8只小鼠,在体多通道电生理记录仪观察各组小鼠的场电位情况。2.选择健康的20-30g C57小鼠并随机分为对照组,siRNA-ubc9抑制组及Ctrl.siRNA空病毒组,AAV-ubc9过表达组及Ctrl.AAV空病毒组。在注射病毒一周或两周后,每组均取5只小鼠,制备离体癫痫小鼠脑片,运用膜片钳技术观察ubc9对癫痫电生理指标的影响。3.将健康的C57小鼠随机分为对照组,siRNA-ubc9抑制组及Ctrl.siRNA空病毒组,AAV-ubc9过表达组及Ctrl.AAV空病毒组。在造模前一周或两周注射病毒,造模一个月后取脑组织标本,免疫印迹检测各组突触后受体的总蛋白和膜蛋白表达,免疫共沉淀检测ubc9、sumo1与突触后受体的相互作用,体外苏化实验检测受体蛋白苏化及各组苏化水平情况。研究结果:1.海人酸癫痫模型中,在体多通道电生理记录显示siRNA-ubc9抑制组癫痫样放电次数和持续时间明显减少,而AAV-ubc9过表达组癫痫样放电次数和持续时间明显增加(n=8,**P<0.01,***P<0.001)。2.离体脑片癫痫模型中,膜片钳技术发现siRNA-ubc9抑制组动作电位频率明显降低,AAV-ubc9过表达组动作电位频率明显升高(n=5,***P<0.001)。siRNA-ubc9抑制组mEPSC频率和幅值均降低;AAV-ubc9过表达组mEPSC频率和幅值均升高(n=5,*P<0.05,***P<0.001)。siRNA-ubc9抑制组AMPA/NMDA电流比值降低;AAV-ubc9过表达组AMPA/NMDA电流比值明显升高(n=5,*P<0.05,**P<0.01)。3.免疫印迹发现各组glur1总蛋白水平无明显差异(n=6,P>0.05)。siRNA-ubc9抑制组glur1膜蛋白/总蛋白比值降低;AAV-ubc9过表达组glur1膜蛋白/总蛋白比值显著升高(n=6,*P<0.05,***P<0.001)。AMPAR亚基glur2-4总蛋白和膜蛋白在各组中均无明显表达差异(n=6,P>0.05)。免疫共沉淀证明ubc9、sumo1与glur1存在相互作用,体外苏化实验发现glur1苏化,且siRNA-ubc9抑制组glur1的苏化水平低于Ctrl.siRNA空病毒组,AAV-ubc9过表达组glur1的苏化水平明显高于Ctrl.AAV空病毒组(n=4,*P<0.05,**P<0.01)。研究结论:1.本团队前期行为学研究已经证明干预ubc9影响戊四氮点燃慢性癫痫小鼠和海人酸癫痫小鼠的癫痫行为学,说明ubc9与癫痫发生发展存在一定的因果关系。在该课题研究中,各组小鼠场电位记录图显示,敲减ubc9抑制小鼠脑电图上癫痫样放电,过表达ubc9促进癫痫样放电。从而从脑电图角度,进一步验证了ubc9与癫痫的因果关系。2.敲减ubc9可降低癫痫小鼠海马CA1区锥体神经元的动作电位频率,过表达ubc9则增加动作电位频率,说明干预ubc9可以有效影响癫痫脑片的神经元兴奋性。敲减ubc9减少兴奋性突触后电流的频率和幅值,过表达ubc9则增加兴奋性突触后电流的频率和幅值,说明ubc9影响了兴奋性/抑制性突触电流平衡。敲减ubc9明显降低了AMPA/NMDA电流比值,过表达ubc9则相反,说明ubc9影响兴奋性突触后受体。本部分从离体脑片方面说明了ubc9对癫痫电生理特性的影响,为ubc9在癫痫作用机制中的探讨提供了有利的线索和证据。3.免疫印迹发现敲减ubc9可降低glur1在膜上的表达,过表达ubc9则增加glur1在膜上的表达,说明ubc9引起兴奋性突触后受体glur1在膜上的数量改变。免疫共沉淀进一步发现ubc9、sumo1与glur1有相互作用,体外苏化实验证明glur1蛋白发生苏化,且发现敲减和过表达ubc9引起glur1苏化水平与膜glur1表达水平一致的改变,提示ubc9可能是通过glur1苏化影响glur1在膜上的表达这一机制在癫痫中发挥作用。