正常角膜组织内缺乏血管和淋巴，在一定程度上阻止了免疫系统对移植抗原的识别，并限制了血缘性效应细胞和分子进入移植的角膜组织。因此角膜移植手术是同种异体器官移植中成功率最高的手术，成功率达90％，但是在血管化的植床、大植片移植（大于8mm）、同时接受过其它器官移植、偏中心移植等所谓高危移植中排斥反应大大增加，在高危穿透性角膜移植中，免疫排斥反应引起的移植失败率高达60％～90％。对于高危角膜移植，其免疫机制仍然不完全清楚，并且没有理想的药物针对其排斥反应进行有效治疗，目前糖皮质激素仍然是用于治疗角膜移植免疫排斥的主要药物，但长期应用大剂量糖皮质激素会引起严重的副作用，包括眼压升高、伤口延迟愈合、白内障及其它全身性副反应。其次环孢霉素A（CsA）也得到了广泛的应用，但是CsA长期应用亦有显著的毒副作用，如：肾毒性、高血压、糖尿病、神经系统毒性等。近年来CsA和FK506滴眼液的开发和应用给角膜移植排斥的防治带来了美好的前景，尽管如此，临床上依然有许多问题函待解决，如血管化植床再次移植的术后排斥反应反复发生，局部用药不能逆转。因此探讨角膜移植免疫排斥反应发生的机理以及基于此基础上开发出理想的药物以抑制高危角膜移植术后的排斥反应，提高植片存活率依然是眼科研究的热点。 螺内酯，又名安体舒通，为醛固酮受体的拮抗剂，过去对它的研究主要针对其抗盐皮质激素效应而展开，临床主要用于伴有醛固酮增多的顽固性水肿，如肝硬化腹水、充血性心力衰竭及肾病综合症等。近年来对该药物的研究不断深入，突破了传统的思维模式，发现其具有强大的抗炎、抗血管生成及抑制免疫排斥反应的作用。 机体多种细胞均能分泌白介素-10（IL-10），IL-10能抑制单核细胞、巨噬细胞等向T细胞递呈抗原的能力，IL-10能够抑制炎症反应和特异性细胞免疫的反应，在获得性免疫应答中可促进免疫耐受和免疫清除功能，正常生理状态下机体内IL-10浓度极低，而当处于感染、自身免疫等状态时分泌量增加，以促进机体平衡状态的恢复。血管内皮生长因子（VEGF）是目前所知唯一作用于血管内皮细胞的多肽类因子，它通过促进血管内皮细胞增殖，增加微静脉通透性，促进细胞质中钙聚集，诱导新生血管的生成，从而加速免疫排斥反应的发生。 因此，本实验通过应用螺内酯，进行观察其对大鼠角膜新生血管生长的影响，及其对大鼠高危角膜移植术后免疫排斥反应的影响，HE染色观察其对大鼠角膜病理改变的影响，并且通过检测角膜组织中IL-10和VEGF蛋白表达量的变化探讨其可能的作用机制。 第一部、分螺内酯对大鼠角膜血管化影响的实验研究。 目的： 研究螺内酯抑制大鼠角膜新生血管生长情况，并且比较不同给药方式对角膜新生血管的影响，检测大鼠新生血管化角膜VEGF的表达量，探讨其抑制大鼠角膜新生血管的可能机制。 方法： 缝线法诱导角膜新生血管模型，50只SD大鼠随机分为正常对照组、角膜新生血管对照组、螺内酯灌胃组（灌喂螺内酯150mg/kg·d），1％螺内酯滴眼液组、1％螺内酯结膜下注射组，比较建模后第3天、7天、12天各组新生血管的生长情况并计算新生血管生长面积，各组大鼠均于术后第12天时取角膜行病理组织学检查，并采用免疫组织化学染色法检测血管内皮生长因子（VEGF）的表达。采用SPSS13.0统计软件包对数据进行分析，计量资料用x±s表示，各时间点上各组新生血管面积的比较采用重复测量数据的方差分析；VEGF表达量采用单向方差分析（One-WayANOVA），组间两两比较当满足方差齐性时用LSD法，不满足方差齐性时用DunnettT3法。以P<0.05表示统计学上有显著性差异。 结果： 缝线后各时间点上，新生血管对照组CNV的面积分别（2.549±1.315）m㎡、（13.998±2.999）m㎡、（23.266±2.833）m㎡；螺内酯灌胃组分别为（0.000±0.000）m㎡、（8.454±2.830）m㎡、（15.189±3.676）m㎡；1％螺内酯滴眼液组分别为（2.614±1.242）m㎡、（14.017±3.684）m㎡、（22.798±4.656）m㎡；1％螺内酯结膜下注射组分别为2.327±1.274）m㎡、（13.625±3.859）m㎡、（22.491±4.001）m㎡；正常对照组未见新生血管。各组之间比较统计学有显著性差异，P<0.05。其中螺内酯灌胃组与其它各组相比均有显著性差异，P<0.05。而滴眼液组、结膜下注射组与新生血管对照组相比均无显著性差异，P>0.05。新生血管对照组角膜组织中VEGF的表达量为22.660±4.158，而螺内酯灌胃组为12.460±1.7542，与新生血管对照组相比显著减少，两组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。1％螺内酯滴眼液组与1％螺内酯结膜下注射组VEGF的表达量分别为21.660±4.698，22.280±4.730，与新生血管对照组相比无显著性差异，P>0.05。 结论： 螺内酯全身应用有效地抑制了大鼠CNV的生长，而局部用药未能抑制CNV的生长，螺内酯全身应用明显减少了角膜组织中VEGF的表达量，认为其对VEGF的抑制作用，可能是螺内酯抑制CNV的机制之一。 第二部分、螺内酯对大鼠高危角膜移植排斥反应的影响。 目的： 观察全身应用螺内酯对大鼠高危角膜移植术后移植排斥反应的抑制作用及其对高危角膜移植术后角膜存活时间的影响，并与全身应用环孢霉素A进行比较。 方法： 取30只SD大鼠作为受体，用角膜缝线法诱导大鼠角膜新生血管，以Wistar大鼠为供体建立高危穿透性角膜移植模型。将受体SD大鼠随机分成螺内酯灌胃组、环孢霉素A灌胃组和蒸馏水对照组。术后观察角膜植片的浑浊、水肿及新生血管化的程度，并进行各项参数的评分，定量分析CNV的生长面积，比较各组角膜植片CNV化程度；比较各组植片的平均存活时间。采用SPSS13.0统计软件包对数据进行分析，计量资料用x±s表示，记录植片的存活时间，绘制Kaplan-Meier曲线，用Long-ranktest进行比较，各组之间角膜植片浑浊度、水肿度、新生血管度以及排斥指数的比较，各时间点上各组新生血管面积的比较采用单向方差分析；组间两两比较当满足方差齐性时用LSD法，不满足方差齐性时用DunnettT3法。以P<0.05为表示统计学有显著性差异。 结果： 高危角膜移植术后，蒸馏水灌胃组的植片平均存活时间为7.80±2.15螺内酯灌胃组植片平均存活时间为13.10±2.69与蒸馏水对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），环孢霉素A灌胃组植片平均存活时间为12.50±2.72，与蒸馏水对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05），而与螺内酯灌胃组相比，无显著性差异，P>0.05。各组之间在不同时间点上植片的浑浊度、水肿度、新生血管度、排斥指数均具有统计学差异，P<0.05。螺内酯灌胃组在各组中比较植片浑浊度、水肿度、新生血管度、排斥指数最低。 结论： 口服螺内酯能有效地抑制角膜移植术后角膜新生血管的生长，延长大鼠高危角膜移植片的存活时间，作用效果优予全身应用CsA，但两者相比在统计学上无显著性差异。 第三部分、螺内酯对大鼠高危角膜移植片VEGF及IL-10表达的影响。 目的： 检测全身应用螺内酯对大鼠角膜移植术后急性排斥反应期角膜移植床VEGF及IL-10表达量的影响，探讨螺内酯抑制角膜移植排斥反应的可能机制。 方法： 取30只SD大鼠作为受体，将成功制作高危角膜移植模型的SD大鼠随机分成螺内酯灌胃组、环孢霉素A灌胃组和蒸馏水对照组。各组大鼠均于术后第10天取大鼠完整角膜植片，制作石蜡切片，HE染色后光镜下观察植片的病理组织形态学特征，免疫组化方法检测VEGF、IL-10的表达情况。采用SPSS13.0统计软件包对数据进行分析，计量资料用x±s表示，VEGF、IL-10的表达量采用单向方差分析（One-WayANOVA），组间两两比较当满足方差齐性时用LSD法，不满足方差齐性时用DunnettT3法。以P<0.05表示统计学上有显著性差异。 结果： 高危角膜移植术后蒸馏水对照组角膜植片VEGF的表达量为25.940±5.258，螺内酯灌胃组为15.280±4.007，与对照组相比，差异具有显著性，P<0.05。环孢霉素A灌胃组为15.760±3.629，与对照组相比，差异具有显著性，P<0.05，而与螺内酯灌胃组相比，两者没有显著性差异，P>0.05。蒸馏水对照组角膜植片IL-10的表达量为5.220±1.687，螺内酯灌胃组为11.120±2.213与对照组相比，差异具有显著性，P<0.05。环孢霉素A灌胃组为4.720±1.911，与对照组相比，差异没有显著性，P>0.05，而与螺内酯灌胃组相比，两者具有显著性差异，P>0.05。总之高危角膜移植术后螺内酯灌胃组与其它两组相比角膜植片VEGF表达量最少，而IL-10的表达量最多。 结论： 全身应用螺内酯抑制高危角膜移植排斥反应的机制可能与抑制VEGF蛋白的表达及活化IL-10的表达有关。