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炎症(Inflammation)为机体受到有害刺激时所产生的一种抗损伤的防御性病理反应,其临床特征为局部的红(Redness)、肿(Swelling)、热(Heat)、痛(Pain)和机体功能障碍(Loss of function),其发热、红肿、疼痛等临床症候与中医的“热”证型所伴有的高热、汗出、舌红苔黄、肌肤生疮发热等症候相似。中医学理论认为“热”和“火”是炎症的主要病因病机,机体感受热邪、或外感寒邪化热、或内有郁积化热而致“热”证,临床多见高热、烦渴、汗出等症。根据“热”的证型以及不同发展阶段,中医对“热”证的治则有清热泻火、滋阴清热、清泄里热、清上温下等。白芍是常用中药,有白芍、赤芍之分,二者各具不同的功效。《医学启源》中记载白芍功能主治包括“安脾经、治腹痛、泻肝”,古方中也不乏有以白芍为君药的方剂,如白芍散,黄莲白芍汤等。在现代医学文献中关于白芍的抗炎免疫活性及作用机制的研究报道甚少,而炎症和免疫在组织、细胞、分子水平上是紧密联系不可分割的过程,因此,本研究拟采用急性炎症模型和疼痛反应模型,观察白芍(以下简称Pae)的抗炎镇痛活性,并从病理组织学、免疫学及分子生物学等角度初步探讨其部分固有免疫分子机制,以期明确白芍抗炎免疫药理活性的作用机理,为中药白芍的进一步研发和有效运用提供理论依据。其试验主要结果及结论如下：1.白芍的抗炎镇痛活性研究试验采用二甲苯致小鼠耳肿胀、醋酸致毛细血管通透性改变试验和]醋酸致小鼠扭体反应试验研究白芍的抗炎镇痛效果。结果表明：白芍的三个剂量(10g/kg、5g/kg和2.5g/kg)均能不同程度抑制小鼠耳肿胀,其高剂量(10g/kg)、中剂量(5g/kg)组的小鼠耳肿胀率分别为22.39%(P<0.05)、28.90%(P<0.01),显著或极显著降低二甲苯致小鼠的耳肿胀。白芍高、中、低剂量的腹腔毛细血管通透性增加抑制率分别为25.12%、41.87%、4.43%,其白芍的中剂量(5g/kg)组的腹腔毛细血管通透性增加抑制率显著高于阴性对照组(P<0.05)。白芍的三个剂量均能降低醋酸致小鼠扭体反应次数,以中剂量(5g/kg)的效果最佳,扭体反应次数抑制率为43.88%,与阴性对照组差异显著(P<0.05)。结果提示：白芍可减轻炎症、舒缓疼痛,具有较强的抗炎镇痛活性。2.小鼠脓毒症模型的建立及白芍对小鼠脓毒症的干预效果通过腹腔注射LPS建立小鼠脓毒症模型,进行白芍干预小鼠脓毒症的试验研究。观察LPS脓毒症模型复制后2h～72h小鼠的临床症候,表现为：LPS攻毒后小鼠山现食欲下降,行动缓慢、倦怠、嗜睡、被毛蓬松等症状,剖检小鼠发现皮下、肠系膜充血或山血,部分肝组织可见白色点状坏死；组织学观察可见LPS模型组在攻毒后前期和后期小鼠肝细胞界限不清或消失,肝窦淤血,炎性细胞浸润,肝细胞变性,部分呈弥漫性坏死；染毒后12h～36h病理变化最明显,表现为中央静脉扩张充血,静脉壁细胞脱落,甚至出现细胞凋亡坏死。经白芍干预治疗后,小鼠的临床症状及剖检症状较LPS模型组有所减轻,肝组织结构有不同程度的损伤,肝小叶结构较清晰,见少量出血,肝细胞排列较紊乱,部分出现变性坏死,可见未完全溶解的核碎屑；48h少数肝细胞炎性浸润伴有轻度水肿,胞浆疏松化,中央静脉少许扩张,周围有少量的肝细胞坏死及炎性浸润：72h肝组织结构清晰,有少量的炎性细胞浸润,肝细胞较完整;白芍干预治疗组小鼠死亡数较LPS脓毒症组少,且其组织病理变化与地塞米松干预组小鼠相近。表明白芍可减轻LPS脓毒症小鼠的临床症候、病理损伤及减少小鼠死亡数,对小鼠脓毒症具有保护作用。3.白芍对LPS脓毒症小鼠肝组织中TLR4及下游相关信号分子mRNA表达量的影响分子固有免疫学研究发现,TLR4能够识别病原相关分子模式(PAMPs),信号转导至细胞内,激活MyD88、NF-κB等基因的转录,进而发挥固有免疫作用,因此,分析信号通路中重要因子表达量的变化可以初步判定药物的作用靶位。本试验分析TLR4/MyD88/NF-KB信号通路中几个重要节点分子表达量的变化,初步确定白芍发挥抗炎作用的固有免疫机制及其可能作用靶标。试验采用实时荧光定量RT-PCR方法检测小鼠肝组织中TLR4、 MyD88、NF-κB、 TNF-α、IL-1p、IL-4和IL-10的mRNA表达水平。结果显示,LPS模型组小鼠的TLR4、MyD88、NF-κB等目的基因mRNA表达水平在12h-36h均不同程度升高,其相对表达量分别12h、36h、24h达到峰值,显著或极显著高于阴性对照组(P<0.05或P<0.01)。而经白芍干预处理的小鼠肝组织中TLR4、MyD88、NF-κB总体水平均低于未给予药物干预的LPS模型组,分别在12h(7.15±0.23 vs 9.44±1.12)、36h(4.44±0.98 vs 13.06±1.7)、24h(3.29±0.43 vs 7.34±2.06)极显著低于LPS模型组；TNF-α、IL-1β的mRNA表达水平亦显著降低(2.37±0.61 vs 7.34±2.06)、(14.92±2.07 vs 15.52±1.12); IL-4的表达水平均高于LPS模型组小鼠,分别在6h、24h-72h与模型组比较差异显著(P<0.05), IL-10 mRNA表达水平均略低于LPS模型组小鼠,36h其表达水平与模型组比较差异极显著P<0.01),但其余时间点与LPS模型组的差异均不显著。研究结果表明：TLR4可识别LPS,并激活TLR4/MyD88/NF-κB信号通路,提高促炎因子相关基因TNF-α、IL-1β mRNA表达的表达水平,导致炎症的发生；白芍可通过TLR4/MyD88/NF-KB信号通路,抑制LPS受体TLR4及信号转导分子MyD88、转录因子NF-κB、促炎细胞因子TNF-α、IL-1β及促进抗炎细胞因子IL-4、IL-10的mRNA水平的表达,达到抑制炎症反应效果。提示TLR4/MyD88/NF-κB信号通路中MyD88、NF-κB等各节点重要分子可能是白芍发挥抗炎作用的靶标。4.白芍对LPS脓毒症小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10及HMGB1含量的影响TNF-α、IL-1β是机体重要的致炎因子,其合成和分泌能够激活炎症反应。IL-4、IL-10是重要的抗炎因子及免疫抑制剂,二者可强烈抑制免疫细胞产生TNF-α、IL-1β等炎症介质,抑制单核-巨噬细胞内NF-κB转位至细胞核。同时,HMGB1作为一种晚期炎症介质,是脓毒症的重要调节因子。中药机制之一为影响信号转导进而调节细胞因子的合成和释放来发挥其抗炎作用。基于此,本试验通过建立小鼠LPS脓毒症模型,以及用白芍干预后2h～72h小鼠外周血中TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10及HMGB1含量的检测,评价白芍对小鼠LPS脓毒症的抗炎效果。试验采用双抗体夹心ELISA方法,建立小鼠血清中炎症相关因子TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10及HMGB1标准曲线,线性相关系数R2>0.99,表明所建立的标准曲线可用于计算待检样品的含量。小鼠经LPS处理后,各时间点血清中致炎细胞因子TNF-α、IL-1β、HMGB1含量均高于阴性对照组,分别在6h、12h、36h达到最大值。而经过白芍处理后,TNF-α、IL-1β、 HMGB1含量峰值的分别为达到328.63±16.49pg/ml、176.38±11.70pg/ml和97.73±11.85ng/ml,较LPS模型组有显著下降(P<0.01或P<0.05)；IL-4水平在36h(128.76±24.68ng/ml)、 48h(95.71±57.09pg/ml)显著高于脓毒症模型组(P<0.05),而IL-10的含量显著高于同时间点阴性对照组,在36h-48h显著低于LPS模型组,但与LPS+地塞米松干预组差异不显著(P>0.05)。研究表明,白芍可显著抑制LPS脓毒症模型小鼠血清中TNF-α、IL-1β、HMGB1的合成与释放,促进IL-4、IL-10的合成与释放。提示白芍可平衡、调节促炎因子TNF-α、IL-1β,抗炎因子IL-4、IL-10及炎症晚期介质HMGB1等蛋白的合成与释放来发挥其抗炎作用。