研究目的:证实活化Wnt经典或非经典Wnt5a/ROR2通路能促进MSCs在ARDS肺组织中的存留及向肺泡Ⅱ型上皮分化，并能增强MSCs修复肺损伤的作用。　　研究内容:通过构建携带目的基因（β-catenin和ROR2基因）的慢病毒载体，以其转染MSCs活化Wnt经典或非经典Wnt5a/ROR2通路，将转染后的MSCs移植入LPS诱导的ARDS小鼠体内，观察转染后的MSCs在肺组织中的存留，向肺泡Ⅱ型上皮细胞分化及修复肺损伤的作用。　　第一部分慢病毒介导的β-catenin或ROR2基因转染的间充质干细胞株构建及鉴定　　目的:构建慢病毒介导的长期稳定高表达或干扰β-catenin或受体酪氨酸激酶样孤受体（Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor2，ROR2）基因的小鼠骨髓来源间充质干细胞(mice bore marrow derived mesenchymal stem cells，mMSCs)细胞株。　　方法:(1)采用直接贴壁法从C57BL/6小鼠原代分离mMSCs，并通过流式细胞学检测表面标志物和诱导成脂、成骨、成软骨分化以对其进行鉴定。(2)通过Gateway clone技术构建高表达β-catenin或ROR2的慢病毒质粒，设立只表达绿色荧光蛋白(Greenfluorescent protein，GFP)的空白对照质粒，通过双酶切法构建干扰β-catenin或ROR2的慢病毒质粒，设立无意义序列的对照质粒，然后分别通过Lipofectamine2000与包装质粒pLV/helper-SL3，pLV/helper-SL4和pLV/helper-SL5共转染293FT细胞进行慢病毒质粒的包装，然后转染mMSCs，高表达细胞株用G418进行药物筛选，挑取克隆纯化传代培养20代后，荧光显微镜下观察报告基因GFP阳性细胞，并通过流式细胞仪分析GFP阳性细胞比率，qRT PCR（Quantitative real-time polymerase chain reaction）法和Western blot法检测mMSCs的β-catenin或ROR2基因和蛋白表达水平评估转染效率。(3) Western blot法检测高表达和干扰β-catenin的mMSCs细胞核内β-catenin蛋白水平，高表达和干扰ROR2的mMSCs与高浓度Wnt5a共孵育后检测磷酸化JNK/总JNK和磷酸化PKC/总PKC水平，评估基因转染后对经典Wnt和非经典Wnt5a/ROR2通路的调控作用。(4)体外诱导转染后细胞株成骨，成脂分化，并通过qRT PCR测定成骨基因Runx2和OSX，成脂基因C/EBPα和PPAR-γ mRNA表达水平，评估基因转染对mMSCs成骨成脂分化的作用;MTT法评估基因转染对mMSCs增殖的作用;划痕实验及Transwell小室迁移实验评估基因转染对mMSCs的迁移能力的作用。　　结果:(1)分离纯化后的mMSCs为成纤维细胞样，流式细胞学鉴定表达CD29、CD34、CD44，不表达CD117，且可体外诱导分化为成脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞。(2)慢病毒介导的高表达或干扰β-catenin或ROR2基因转染mMSCs，传代培养20代后，转染效率仍高达92.61％-97.04％，高表达β-catenin或ROR2基因的mMSCs的β-catenin或ROR2 mRNA和蛋白水平均显著增加，干扰β-catenin或ROR2基因的mMSCs的β-catenin或ROR2 mRNA和蛋白水平均显著降低。(3)高表达β-catenin基因的mMSCs细胞核内β-catenin的蛋白水平明显增加，而干扰β-catenin基因后mMSCs核内β-catenin的蛋白水平明显减少;与高浓度Wnt5a共孵育后高表达ROR2基因的mMSCs的磷酸化JNK/总JNK和磷酸化PKC/总PKC明显增加，干扰ROR2基因的mMSCs的磷酸化JNK/总JNK和磷酸化PKC/总PKC明显减少。(4)高表达β-catenin或ROR2促进mMSCs成骨分化同时抑制成脂分化，而干扰β-catenin或ROR2抑制mMSCs成骨分化同时促进成脂分化;高表达β-catenin或ROR2促进mMSCs水平和垂直迁移，并促进mMSCs增殖，而干扰β-catenin或ROR2抑制mMSCs水平和垂直迁移，并抑制mMSCs增殖。　　结论:慢病毒载体介导的β-catenin或ROR2基因改造能实现有效而稳定的mMSCs的Wnt信号通路的调控，并进一步影响mMSCs在体外的成骨和成脂分化，增殖和迁移。这种在表型和功能上稳定长期改变Wnt信号通路的mMSCs细胞株的成功构建有助于在体研究Wnt信号通路对mMSCs细胞功能的影响。　　第二部分经典Wnt通路对MSCs在ARDS小鼠体内向Ⅱ型肺泡上皮细胞分化的调节及肺损伤修复作用的影响　　目的:明确经典Wnt/β-catenin通路在ARDS小鼠体内对mMSCs向ARDS小鼠的肺组织迁移存留及向ATⅡ细胞分化的作用，以及对mMSCs修复ARDS小鼠肺损伤的调节作用。　　方法:C57BL/6小鼠随机分为NS+PBS组（正常对照组），LPS+PBS组(ARDS组)，LPS+MSC-GFP组（MSC-GFP治疗组），LPS+MSC-Ctnnb1组（高表达β-catenin的MSC-Ctnnb1治疗组），气道内滴入LPS诱导ARDS小鼠动物模型，按分组经不同处理后3d，7d，14d(1)处死小鼠留取肺组织，HE染色行组织病理学检查和肺损伤评分评价肺损伤程度;记录各组小鼠生存只数评价14d病死率;近红外成像追踪离体肺中NIR815标记的MSCs以及免疫荧光染色评价MSCs在肺组织中的存留;免疫荧光双染色共定位及Western blot检测肺组织中SP-C表达水平评价MSCs在肺组织中向ATⅡ细胞分化;计算肺湿重/体重比评价肺水肿程度;Western blot检测肺组织中Occuldin表达水平评价MSCs对肺上皮细胞紧密连接的作用;Masson染色及Ashcroft评分评价肺纤维化程度。(2)或留取肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，ELISA法检测IL-1beta、IL-6、IL-10的浓度评价肺部炎症反应的强度;ELISA法检测总蛋白和白蛋白水平评价肺上皮通透性;ELISA法检测角化细胞生长因子(Keratinocyte growth factor，KGF)水平评价MSCs的旁分泌对肺通透性的影响。　　结果:(1)高表达β-catenin的MSCs与MSC-GFP比较能更显著减轻LPS诱导的ARDS小鼠肺病理损伤，肺损伤评分LPS+MSC-Ctnnb1组与LPS+MSC-GFP组比较[3d:(7.57±0.27) vs(9.07±0.43);7d:(5.08±0.63) vs(6.45±0.64);14d:(2.87±0.25) vs(4.07±0.29)，P＜0.05];虽然两组14d病死率无统计学差异，但有下降趋势[16.7％ vs25％，P＞0.05]。(2)高表达β-catenin增加MSCs在LPS诱导的ARDS小鼠肺组织的存留。LPS诱导后3d，7d和14d进行小鼠离体肺的近红外成像，经过颜色编码的荧光图像分析发现LPS+MSC-Ctnnb1组小鼠离体肺图像信号明显高于LPS+MSC-GFP组;对小鼠肺组织进行免疫荧光染色，荧光显微镜下观察发现LPS+MSC-Ctnnb1组小鼠肺组织内GFP阳性细胞数量明显高于LPS+MSC-GFP组。(3)高表达β-catenin促进MSCs在LPS诱导的ARDS小鼠肺内向Ⅱ型肺泡上皮细胞分化。LPS诱导后14d取小鼠肺组织进行免疫荧光双染色，荧光显微镜下发现LPS+MSC-Ctnnb1组小鼠肺组织内GFP和SP-C双染阳性mMSCs细胞数量明显高于LPS+MSC-GFP组;Western blot法检测发现LPS+MSC-Ctnnb1组小鼠肺组织SP-C蛋白水平表达显著高于LPS+MSC-GFP组[(0.66±0.11) vs(0.48±0.08)，P＜0.05]。(4)高表达β-catenin的MSCs减轻LPS诱导的ARDS小鼠肺炎症反应。LPS诱导后3d，高表达β-catenin的MSCs与MSC-GFP比较能更降低IL-1 beta水平[(64.89±8.25) vs(90.68±14.33) pg/ml，P＜0.05]和增加IL-10水平[(214.32±18.89) vs(151.39±11.71) pg/ml，P＜0.05]从而更减轻ARDS小鼠肺炎症反应。(5)高表达β-catenin的MSCs改善LPS诱导的ARDS小鼠肺通透性。LPS+MSC-Ctnnb1组与LPS+MSC-GFP组比较:LPS诱导后3d及14d的LWW/BW明显降低;3d，7d及14d的BALF中TP和ALB浓度显著降低;14d的肺组织中上皮紧密连接蛋白occludin的表达显著增加;14d的小鼠BALF中的KGF浓度显著增加。(6)高表达β-catenin的MSCs减轻LPS诱导的ARDS小鼠肺纤维化。LPS诱导后14d小鼠肺纤维化评分LPS+MSC-Ctnnb1组与LPS+MSC-GFP组比较[(0.67±0.12) vs(1.37±0.08)，P＜0.05]。　　结论:高表达β-catenin活化经典Wnt/β-catenin通路，能增加mMSCs在ARDS小鼠肺组织存留，促进mMSCs向ATⅡ细胞分化;促进mMSCs对肺炎症损伤修复;改善肺上皮通透性及减轻肺水肿程度及增强mMSCs改善肺纤维化的作用，从而促进mMSCs修复ARDS肺损伤。由此可以推测经典Wnt/β-catenin通路对调节mMSCs在ARDS肺内存留，分化为ATⅡ细胞和修复肺损伤发挥了重要作用。　　第三部分非经典Wnt通路对MSCs在ARDS小鼠体内向Ⅱ型肺泡上皮细胞分化的调节及肺损伤修复作用的影响　　目的:明确非经典Wnt5a/ROR2通路在ARDS小鼠体内对mMSCs向ARDS小鼠的肺组织迁移存留及向ATⅡ细胞分化的作用，以及对mMSCs修复ARDS小鼠肺损伤的调节作用。　　方法:(1) LPS气道内滴入诱导ARDS模型，模型复制成功后立即处死小鼠取肺组织，western blot检测Wnt5a蛋白水平，气道内滴入与LPS等体积NS的小鼠作为正常对照组(n=4)。(2)C57BL/6小鼠随机分为NS+PBS组（正常对照组），LPS+PBS组(ARDS组)，LPS+MSC-GFP组(MSC-GFP治疗组)，LPS+MSC-ROR2组（高表达ROR2的MSC-ROR2治疗组），气道内滴入LPS诱导的ARDS小鼠动物模型，按分组经不同处理后3d，7d，14d处死小鼠留取肺组织，HE染色行组织病理学检查和肺损伤评分评价肺损伤程度;记录各组小鼠生存只数评价14d病死率;近红外成像追踪离体肺中NIR815标记的MSCs以及免疫荧光染色评价MSCs在肺组织中的存留;免疫荧光双染色共定位及Western blot检测肺组织中SP-C表达水平评价MSCs在肺组织中向ATⅡ细胞分化;计算肺湿重/体重比评价肺水肿程度;Western blot检测肺组织中Occuldin表达水平评价MSCs对肺上皮细胞紧密连接的作用;Masson染色及Ashcroft评分评价肺纤维化程度。(3)或留取肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid，BALF），ELISA法检测IL-1beta、IL-6、IL-10的浓度评价肺部炎症反应的强度;ELISA法检测总蛋白和白蛋白水平评价肺上皮通透性;ELISA法检测KGF水平评价MSCs的旁分泌对肺通透性的影响。　　结果:(1)LPS诱导的ARDS小鼠肺组织较正常肺组织的Wnt5a水平明显增高[(0.69±0.06) vs(0.33±0.03)，P＜0.05]。(2)高表达ROR2的MSCs与MSC-GFP比较能更显著减轻LPS诱导的ARDS小鼠肺病理损伤，肺损伤评分LPS+MSC-ROR2组与LPS+MSC-GFP组比较[3d:(8.83±0.23) vs(9.07±0.43);7d:(4.97±0.55) vs(6.45±0.64);14d:(3.08±0.32) vs(4.07±0.29)，P＜0.05];虽然两组14d病死率无统计学差异，但有下降趋势[20.8％ vs25％，P＞0.05]。(3)高表达ROR2增加MSCs在LPS诱导的ARDS小鼠肺组织的存留。LPS诱导后3d，7d和14d进行小鼠离体肺的近红外成像，经过颜色编码的荧光图像分析发现LPS+MSC-ROR2组小鼠离体肺图像信号明显高于LPS+MSC-GFP组;对小鼠肺组织进行免疫荧光染色，荧光显微镜下观察发现LPS+MSC-ROR2组小鼠肺组织内GFP阳性细胞数量明显高于LPS+MSC-GFP组。(4)高表达ROR2促进MSCs在LPS诱导的ARDS小鼠肺内向Ⅱ型肺泡上皮细胞分化。LPS诱导后14d取小鼠肺组织进行免疫荧光双染色，荧光显微镜下发现LPS+MSC-ROR2组小鼠肺组织内GFP和SP-C双染阳性mMSCs细胞数量明显高于LPS+MSC-GFP组;Western blot法检测发现LPS+MSC-ROR2组小鼠肺组织SP-C蛋白水平表达显著高于LPS+MSC-GFP组[(0.70±0.11) vs(0.48±0.08)，P＜0.05]。(5)高表达ROR2的MSCs减轻LPS诱导的ARDS小鼠肺炎症反应。LPS诱导后3d，高表达ROR2的MSCs与MSC-GFP比较能更降低IL-1 beta水平[(66.69±9.28) vs(90.68±14.33) pg/ml，P＜0.05]和增加IL-10水平[(285.94±26.30) vs(151.39±11.71) pg/ml，P＜0.05]从而更减轻ARDS小鼠肺炎症反应。(6)高表达ROR2的MSCs改善LPS诱导的ARDS小鼠肺通透性。LPS+MSC-ROR2组与LPS+MSC-GFP组比较:LPS诱导后3d及14d的LWW/BW明显降低;3d，7d及14d的BALF中TP和ALB浓度显著降低;14d的肺组织中上皮紧密连接蛋白occludin的表达显著增加;14d后小鼠BALF中的KGF浓度显著增加。(7)高表达ROR2的MSCs减轻LPS诱导的ARDS小鼠肺纤维化。LPS诱导后14d小鼠肺纤维化评分LPS+MSC-ROR2组与LPS+MSC-GFP组比较[(0.85±0.15) vs(1.37±0.08)，P＜0.05]。　　结论:LPS诱导ARDS时肺组织高表达的非经典Wnt5a配体通过与高表达其受体ROR2的mMSCs结合后活化非经典Wnt5a/ROR2通路，能增加mMSCs在ARDS小鼠肺组织存留，促进mMSCs向ATⅡ细胞分化;促进mMSCs对肺炎症损伤修复;改善肺上皮通透性及减轻肺水肿程度及增强mMSCs改善肺纤维化的作用，从而促进mMSCs修复ARDS肺损伤。由此可以推测非经典Wnt5a/ROR2通路也对调节mMSCs在ARDS肺内存留，分化为ATⅡ细胞和修复肺损伤发挥了重要作用。