论文部分内容阅读
背景:糖尿病是一种因胰岛素分泌或功能异常引起机体慢性高血糖为特征的代谢性疾病,其慢性并发症是引起患者致残和致死的重要原因,以糖尿病冠状动脉病变尤为严重,可引起急性心肌梗死和心律失常。大电导钙激活钾离子通道(large conductance calcium activated potassium channels,BK通道)是冠状动脉平滑肌上分布最广泛的钾离子通道,在血管平滑肌细胞静息膜电位和血管张力调节中发挥重要作用。近年来,有研究表明n-3多不饱和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids,n-3PUFAs)作为人体必需脂肪酸主要包括二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA),具有抗氧化应激、抗炎降脂和预防心肌梗死等心血管系统保护作用,但具体机制尚不明确,可能与通过细胞色素P450氧化酶(Cytochromes P450 epoxygenase,CYP450氧化酶)CYP450氧化酶作用影响冠状动脉平滑肌细胞BK通道有关。目的:探讨n-3多不饱和脂肪酸通过CYP450氧化酶对糖尿病大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道的激活作用及其机制。方法:(1)采用腹腔注射链脲霉素建立Ⅰ型糖尿病大鼠动物模型,予每日鱼油灌胃,腹腔注射普罗地芬(proadifen,SKF525A)建立实验大鼠动物模型;(2)采用三步酶消化法分离大鼠冠状动脉平滑肌细胞;(3)采用全细胞膜片钳实验技术记录孵育SKF525A前后灌流不同浓度DHA和EPA对大鼠冠状动脉平滑肌BK通道电流密度影响,及造模后各组间大鼠冠状动脉平滑肌BK通道电流密度的差异;(4)采用微血管张力测定技术检测在BK通道抑制剂伊比蝎毒素(Iberiotoxin,IBTX)未孵育和孵育条件下,不同浓度DHA和EPA对大鼠冠状动脉舒张功能的影响,检测BK通道抑制剂IBTX和激动剂NS1619对造模后各组大鼠冠状动脉收缩和舒张功能的影响;(5)采用Western blotting和qRT-PCR实验技术检测造模后八组大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道亚单位蛋白和基因表达;(6)采用细胞内钙离子成像技术检测造模后八组冠状动脉平滑肌细胞内钙离子浓度变化。结果:(1)成功建立Ⅰ型糖尿病大鼠动物模型,造模前后大鼠体重分别为(202.1.75±3.52)g和(294.32±21.52)g(P<0.05,n=40);血糖水平为(7.28±0.49)mmol/L和(31.23±0.85)mmol/L(P<0.05,n=40),造模成功率93.02%;(2)灌流0.01μmol/L、0.03μmol/L、0.1μmol/L、0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L和10μmol/LDHA或EPA,可以增加BK通道电流密度,并且呈浓度依赖性,孵育SKF525A后,激活作用被明显抑制;(3)内皮素-1(ET-1)收缩正常组和糖尿病组冠状动脉后,加入0.1μmol/L、1μmol/L、3μmol/L、10μmol/L、30μmol/L和100μmol/L DHA或EPA,血管舒张并且呈浓度依赖性,且DHA/EPA对糖尿病组血管的舒张作用弱于正常组的。孵育IBTX后,DHA/EPA对大鼠冠状动脉的舒张作用被明显抑制;(4)正常组、灌胃鱼油正常组、注射SKF525A正常组和、灌胃鱼油并注射SKF525A正常组大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK-α亚单位和BK-β1亚单位基因和蛋白表达无明显差异(P>0.05,n=6)。糖尿病四组中BK-α亚单位基因和蛋白表达无明显差异,BK-β1亚单位基因相对表达分别为0.91±0.06、1.38±0.17、0.92±0.10、和1.17±0.06(P<0.05,n=6),BK-β1亚单位蛋白相对表达分别为0.99±0.06、1.89±0.17、0.92±0.05、和1.43±0.18(P<0.05,n=6)。(5)正常组、灌胃鱼油正常组、注射SKF525A正常组和灌胃鱼油并注射SKF525A正常组大鼠冠状动脉平滑肌细胞电流密度无明显差异。与糖尿病组相比,注射SKF525A糖尿病组BK电流密度无明显差异,灌胃鱼油糖尿病组BK电流明显较高,灌胃鱼油并注射SKF525A糖尿病组BK电流略高但低于灌胃鱼油糖尿病组(P<0.05,n=6);(6)分别使用KCl和IBTX收缩八组冠状动脉,其血管IBTX/KCl%值,正常四组间无明显差异(P>0.05,n=5-6),灌胃鱼油并注射SKF525A糖尿病组比值高于糖尿病组和注射SKF525A组,低于灌胃鱼油组(P<0.05,n=5-6)。使用BK通道激活剂NS1619在预先使用KCl预收缩情况下其舒张的比例,灌胃鱼油并注射SKF525A糖尿病组比值高于糖尿病组和注射SKF525A组,低于灌胃鱼油组(P<0.05,n=5-6);(7)细胞内钙离子浓度荧光信号比值(Ratio),正常四组间无明显差异(P>0.05,n=5),糖尿病四组中,单纯糖尿病组和注射SKF525A组无差异(P>0.05,n=5-6),灌胃鱼油并注射SKF525A糖尿病组细胞内钙离子浓度明显低于单纯糖尿病组,高于灌胃鱼油组(P<0.05,n=5-6)。结论:(1)n-3PUFAs的主要成分EPA和DHA均可激活糖尿病大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道,从而舒张冠状动脉;(2)糖尿病时大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道受损,n-3PUFAs可以通过CYP450氧化酶代谢产物或者直接作用,增加BK-β1表达和BK通道电流,并降低细胞内钙离子浓度,从而保护糖尿病冠状动脉。