豆粕由于具有蛋白含量高、氨基酸组成相对均衡等优点成为水产饲料中鱼粉的常用替代蛋白源。然而,植物原料中存在的抗营养因子是限制植物蛋白在水产配合饲料中应用的重要因素之一。作为豆粕中含量高、热稳定性强的抗营养因子,大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白对甲壳动物的肠道健康和生长性能的影响却鲜有研究。本研究利用分子生物学和组织形态学手段,探讨了大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)幼蟹生长和肠道健康的影响。针对两种抗原蛋白对中华绒螯蟹肠道不同的作用特点,分别应用功能性添加剂氮-乙酰半胱氨酸和丁酸钠,探究了其改善β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白引起的幼蟹生长抑制和肠道损伤。通过比较丁酸钠处理组与对照组肠道菌群16S rRNA的测序结果,分析了丁酸钠对幼蟹肠道菌群结构的修复效果。利用中华绒螯蟹肠道微生物的体外培养和筛选的手段,探究了提高大豆球蛋白利用率的益生菌筛选和活体应用效果。研究结果不仅为改善中华绒螯蟹肠道健康的营养调控提供了借鉴,也为合理利用植物蛋白源和科学配置中华绒螯蟹饲料提供了参考。1.大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白对中华绒螯蟹幼蟹生长和肠道健康的影响本实验为研究大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白对中华绒螯蟹幼蟹的生长、消化能力、肠道健康和微生物组成的影响,分别配制了四种含有两种抗原蛋白(7%和14%的β-伴大豆球蛋白,8%和16%的大豆球蛋白)的饲料,以及不含抗原蛋白的对照组共5组等氮等脂的饲料,养殖7周。结果显示两种抗原蛋白都会显著降低幼蟹的存活率和增重率,同时提高肠道丙二醛含量,降低过氧化氢酶活性。大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白还显著降低了幼蟹肠道胰蛋白酶和淀粉酶的活性。此外,抗原蛋白还造成了幼蟹肠道免疫和形态结构损伤,尤其是肠道围食膜的正常形态结构。饲料抗原蛋白的添加上调了幼蟹肠道炎症相关因子脂多糖诱导型TNF-α因子LITAF和白细胞介素2转录因子ILF2的表达,下调了围食膜因子围食膜因子peritrophin-like gene和peritrophic 2的表达。抗原蛋白还改变了幼蟹肠道微生物菌群结构和组成,两种抗原蛋白都提高了病原菌Ochrobactrum、Burkholderia和Pseudomonas的丰度。另外,大豆球蛋白处理组中弧菌属丰度显著提高,而能够分解木质纤维素的有益菌Dysgonomonas属丰度却显著下降。本研究表明饲料抗原蛋白能够引起中华绒螯蟹肠道炎症,改变肠道菌群结构,降低消化能力,最终导致生长性能下降。2.氮-乙酰半胱氨酸改善两种大豆抗原蛋白引起的中华绒螯蟹幼蟹生长抑制和肠道损伤为了探究N-乙酰半胱氨酸(NAC)分别对β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白引起的中华绒螯蟹幼蟹生长抑制和肠道损伤的改善作用,设计了两个实验。实验1设计了三组含7%β-伴大豆球蛋白,分别添加0、0.05%、0.1%的NAC,以及不含β-伴大豆球蛋白和NAC的对照共4组等氮等脂饲料;实验2设计了三组含8%大豆球蛋白,分别添加0、0.05%、0.1%的NAC,以及不含大豆球蛋白和NAC的对照共4组等氮等脂饲料。饲喂初重为3.06±0.03g的幼蟹8周。实验1结果显示,β-伴大豆球蛋白显著降低幼蟹存活率和增重率,0.1%的NAC能够显著提高幼蟹的成活率和增重率,且与对照组无显著差异。β-大豆球蛋白显著降低了幼蟹肠道谷胱甘肽和过氧化氢酶活性,并提高了丙二醛的含量。此外,β-大豆球蛋白还显著提高了幼蟹肠道组胺水平和血清中二胺氧化酶的活性。肝胰腺脂肪酶和胰蛋白酶活性以及肠道胰蛋白酶活性受β-大豆球蛋白影响而降低,饲料中补充NAC能够有效改善这种不利影响。NAC还能改善大豆抗原蛋白对幼蟹肠道免疫功能和形态结构的损伤。此外,饲料NAC能够下调促炎相关基因(脂多糖诱导型TNF-α因子LITAF、EsRelish和白细胞介素2转录因子ILF2)的表达,同时上调维持肠道内部形态的围食膜因子(peritrophin-like gene、peritrophic 1和2)的表达。实验2结果显示,大豆球蛋白显著降低幼蟹存活率和增重率,0.1%的NAC能够显著提高幼蟹的成活率,但仍显著低于对照组,对幼蟹的生长性能没有明显的改善。大豆球蛋白显著降低了幼蟹肠道谷胱甘肽和过氧化氢酶活性,且提高了丙二醛的含量。肝胰腺和肠道胰蛋白酶活性受大豆球蛋白影响而降低,饲料中补充NAC能够有效改善这种不利影响。此外,NAC对大豆球蛋白引起的幼蟹肠道围食膜损伤以及围食膜因子mRNA下调有一定的缓解作用,但没有恢复到对照组水平。大豆球蛋白显著提高了幼蟹肠道组胺水平和血清中二胺氧化酶的活性,同时降低了抗脂多糖因子(ALF1、ALF2和ALF3)的基因表达,NAC除了提高ALF1的表达量,对其他指标的变化没有影响。本实验研究表明NAC可以作为改善β-大豆球蛋白引起河蟹的生长抑制、肠道氧化损伤和炎症反应的有效功能性添加剂,同时可以缓解大豆球蛋白引起的肠道氧化应激,但对大豆球蛋白引起的肠道围食膜损伤和肠道免疫力下降的改善效果不甚理想。3.丁酸钠改善大豆球蛋白引起的中华绒螯蟹幼蟹生长抑制和肠道损伤鉴于NAC仅改善了大豆球蛋白引起的中华绒螯蟹幼蟹肠道氧化应激,本实验从改善肠道菌群结构角度出发,探究了丁酸钠(NaB)对大豆球蛋白诱导的中华绒螯蟹生长抑制和肠道损伤的缓解作用。本实验在所有处理组添加0.1%的NAC的基础上,配制了4组含8%大豆球蛋白,分别添加0、1%、2%和4%的NaB,以及不含大豆球蛋白和NaB的对照组共5组等氮等脂饲料。分别饲喂初重为0.33±0.01g的幼蟹8周。与0%NaB组相比,添加1%和2%NaB的饲料显著提高了幼蟹的存活率和增重率,且与对照组无显著性差异。饲喂含有大豆球蛋白不含NaB的饲料的幼蟹与对照组相比,其谷胱甘肽和谷胱甘肽过氧化物酶活性较低,但丙二醛含量较高。此外,与对照组相比,大豆球蛋白降低了幼蟹肠道溶菌酶和酚氧化酶的活性,并提高了组胺的水平,而补充NaB可以显著改善上述这些负面的影响。NaB的添加还可以改善幼蟹肠道的免疫力和形态结构。饲料NaB可以上调抗菌肽基因(抗脂多糖因子1和2)的mRNA表达水平,并降低促炎因子TNF-α的含量。NaB可以修复由大豆球蛋白引起的肠道微生物群落种类和数量的改变。在1%NaB组中,致病菌(气单胞菌,弧菌和假单胞菌)的丰度显著降低,益生菌(芽孢杆菌,乳杆菌,Chitinibacter和Dysgonomonas)丰度显著提高。本实验表明,丁酸钠的补充可以改善由大豆球蛋白诱导的中华绒螯蟹蟹生长抑制、肠道炎症和肠道有益菌群的减少等不利影响。4.提高大豆球蛋白利用率的益生菌筛选与效果评价基于饲料中添加丁酸钠能够显著改善大豆球蛋白引起的中华绒螯蟹幼蟹生长抑制和肠道健康的结果,本实验选取丁酸钠改善组的幼蟹肠道样品,对能够利用大豆球蛋白且提高肠道免疫力益生菌的体外筛选,然后通过活体饲养实验评估筛选的益生菌对中华绒螯蟹的有益作用。以对大豆球蛋白利用能力、细胞外消化酶分泌能力、溶血活性等为标准预先筛选12株潜在益生菌,然后通过对病原菌的拮抗能力、人工消化液的耐受性、细胞表面疏水性和自凝集等条件的筛选,最终确定了三株潜在益生菌:Z9、Z34和Z98,对上述所有标准均表现出良好的益生特性。通过生化生理实验和16S rRNA测序分析,确定Z9、Z34和Z98分别为腐败希瓦氏菌、枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌。设计5组等氮等脂饲料,以鱼粉和酪蛋白为主要蛋白源的阳性对照(C),添加8%水平的大豆球蛋白为阴性对照(11S),11S基础上分别添加10~9 cfu/g Z9、Z34和Z98的饲料,分别记为SP、BS和BP。选取初始均重为(0.28±0.01g)的幼蟹在室内水箱内进行为期8周的养殖实验。结果显示:SP组和BP组的成活率显著高于11S组,与对照组无显著性差异。BP和BS组的增重率和特定生长率显著高于11S组,与对照组无显著性差异。这三株益生菌都可以显著提高幼蟹肝胰腺和肠道类胰蛋白酶,降低血细胞活性氧水平和血清二胺氧化酶活性。BP和SP组对幼蟹肠道围食膜和肠道免疫力修复作用明显。肠道菌群结果显示,BP组可以提高菌群多样性,三种益生菌都能提高益生菌属丰度,降低病原菌的丰度。最后,采用Biolog-ECO法对幼蟹肠道微生物代谢活性进行了分析,发现摄食益生菌的实验组的平均颜色变化率明显提高,其中BP组最高,表明益生菌增强了肠道微生物代谢活性。本实验表明三种益生菌能够提高幼蟹肠道抗氧化能力,改善大豆球蛋白引起的肠道炎症,同时提高幼蟹消化酶活性和消化能力,最终提高中华绒螯蟹的生长性能,综合成活率和增重率指标得出,Z98短小芽孢杆菌是一种可以提高河蟹对大豆球蛋白利用的最佳益生菌。