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阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)是一种最常见的老年痴呆症,目前全世界患病人数已超过3500万。AD的特征性病理改变是脑内神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles, NFTs)的形成,老年斑(Senile plaques, SP)大量沉积和神经元退变死亡。到目前为止,AD的病因尚未阐明。临床上仅有5%的患者被发现存在相关致病基因,95%为散发性,提示AD的发生和环境因素密切相关。幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori)为寄生在胃黏膜的革兰氏阴性螺旋杆菌,全球大约有一半以上的人胃内有H.pylori感染,其中老年人群感染率尤高。大量临床研究表明,H.pylori慢性感染不仅直接导致慢性胃炎、胃溃疡并促进胃癌发生,也可引起或促进消化系统外疾病,如格林巴利综合症(脊神经和周围神经的脱髓鞘疾病)、高血压、缺血性心脏病、脑缺血和中风,而这些疾患均为AD发生的危险因子。最近的一些临床流行病学调查研究为H.pylori感染与AD相关提供了更为直接的临床证据。但是H.pylori感染到底通过何种途径促进AD的发生,其机制尚无报道。本研究中重点探讨了H.pylori感染对tau蛋白磷酸化、Aβ40、Aβ42生成以及大鼠空间学习记忆的影响及其机制。主要结果如下：第一部分幽门螺旋杆菌通过激活GSK-3β导致AD样tau蛋白过度磷酸化微管相关蛋白tau的过度磷酸化参与包括阿尔茨海默病在内的许多神经退行性疾病的发生。有报道认为幽门螺旋杆菌感染是AD发病的危险因素,但尚无直接的实验证据。[目的]阐明H.pylori感染对tau蛋白磷酸化的影响及其机制。[材料和方法]实验在整体和细胞水平进行。整体水平采用雄性SD大鼠,腹腔注射H.pylori滤液,280μl/只/天,给滤液浓度研究分组如下：DMEM/Opti-MEM混合培养基(体积比1：1)对照组、中浓度和高浓度H.pylori滤液注射组、对应浓度大肠杆菌(Escherichia coli. E.coli)滤液注射对照组,依据浓度实验结果确定给滤液时间点研究分组如下：DMEM/Opti-MEM混合培养基注射14天对照组、中浓度H.pylori滤液注射7天组、14天组和21天组,注射完毕后,麻醉取脑分离海马,用免疫印迹检测tau蛋白AD相关位点磷酸化水平,用免疫组化检测tau蛋白在神经元内的定位及小胶质细胞活化情况,用酶联免疫吸附检测炎症介质IL-8和TNF-a的含量。细胞水平采用小鼠成神经瘤(N2a)细胞系,给滤液浓度研究分组如下：DMEM/Opti-MEM混合培养基作为对照,低、中、高浓度H.pylori滤液孵育24小时组,对应浓度E.coli滤液孵育24小时组。依据浓度实验结果给滤液时间点研究分组如下：DMEM/Opti-MEM混合培养基对照组,中浓度H.pylori滤液孵育6、24和36小时组。免疫印迹检测tau磷酸化水平,tau相关蛋白激酶／磷酸酯酶活性；给予GSK-3抑制剂氯化锂和SB216763预处理N2a细胞30分钟,再用H.pylori滤液孵育24小时,免疫印迹检测tau磷酸化水平。[结果]H.pylori滤液大鼠腹腔注射或孵育小鼠成神经瘤细胞均导致AD相关tau蛋白磷酸化位点如Thr205、Thr231和Ser404明显过度磷酸化,并伴有糖原合酶激酶-3β (glycogen synthase kinase-3β, GSK3β)的激活。给予GSK-3抑制剂能有效逆转H.pylori滤液导致的tau蛋白过度磷酸化。相同处理不影响使tau蛋白去磷酸化的关键蛋白磷酸酯酶-2A(protein phosphatase-2A, PP2A)的活性。另一种常见的肠道细菌E.coli同样处理不影响tau磷酸化水平。[结论]H.pylori滤液在体内外可通过激活GSK3β导致AD样tau蛋白过度磷酸化,促进AD样病变的形成。本实验结果为H.pylori感染在AD样tau病变中的作用提供了直接实验证据。第二部分幽门螺旋杆菌通过增加早老素2的表达使β-淀粉样肽含量升高,损伤大鼠空间学习记忆H.pylori感染是AD的高危因素,我们已经在第一部分阐明H.pylori滤液腹腔注射可通过激活GSK-3β导致AD样tau蛋白过度磷酸化,那么H.pylori外周感染对AD的其他病变如认知功能和p淀粉样肽生成是否有影响?其机制如何尚无报道。[目的]阐明H.pylori对SD大鼠认知功能和p淀粉样肽生成的影响及其机制。[材料和方法]实验在整体和细胞水平进行。整体水平采用3月龄SD雄性大鼠,Morris水迷宫训练7天至15秒内能找到隐匿平台,形成空间记忆。然后随机分为对照组,H.pylori组和E.coli组,分别腹腔注射体积比为1：1的DMEM/Opti-MEM混合培养基,H.pylori滤液和E.coli滤液,280μl/只/天连续注射7天。注射第4天时水迷宫检测大鼠空间记忆保留情况。然后更换平台到新的象限水迷宫重新学习3天,训练结束24小时后检测大鼠对第二次学习的记忆力。第9天,水迷宫可视平台进行运动能力检测后处死动物,高尔基染色观察海马DG区树突棘密度和形态,尼氏染色观察海马和皮质区神经元数量和密度。麻醉取脑分离海马和皮质组织匀浆,并提取海马膜蛋白,用免疫印迹检测学习记忆相关突触受体蛋白在全海马匀浆及海马神经细胞膜的表达量及海马和皮质p-分泌酶(BACE-1),γ-分泌酶主要成分(早老素-1,PS-1和早老素-2,PS-2)的表达量。酶联免疫吸附分别检测海马和皮质Aβ含量。细胞水平用H.pylori或E.coli滤液孵育过表达了APP的小鼠成神经瘤细胞(N2a-APP)24小时然后检测Ap含量及p和γ-分泌酶表达量。[结果]H.pylori滤液腹腔注射导致SD大鼠空间学习和记忆损伤并伴有海马DG区树突棘成熟障碍,同时海马和皮质的Aβ42含量明显升高且PS-2表达增加。在细胞水平用H.pylori滤液孵育N2a-APP细胞,检测发现H.pylori滤液孵育后细胞内、外Aβ42水平均升高,同时伴有PS-2上调。用E.coli做相同处理对大鼠认知功能无影响,在细胞和整体水平也均未发现Ap含量明显变化。[结论]H.pylori外周感染后释放某种可溶性成份可通过增加PS-2的表达量来增强γ分泌酶活性直接促使Aβ42生成和释放增加,后者干扰神经突触功能导致大鼠认知功能损伤,而且H.pylori滤液产生的上述影响是特异性的(E.coli无此影响),这为阐明H.pylori外周感染与AD发病的内在关联提供了新的实验证据。