蘑菇类真菌(mushrooms)是高等真菌中的一大类,很多种类具有丰富的食用和药用价值,因其含有多种重要的生物活性物质而受到研究者们的广泛关注,研究表明这些物质有抗癌、抗炎、抗高血压、提高免疫力等多种药理活性。然而在蘑菇类真菌中的基因编辑方法还存在一定的问题,尤其是基因中断技术,现有报道的基因中断技术大多是通过同源重组的方式进行的,但蘑菇类真菌中极低的同源重组比例(如在裂褶菌中只能从10~7原生质体中得到1-2个基因中断菌株)使得大部分此类真菌如灵芝、平菇、茯苓等物种都没有基因中断的报道。这对于蘑菇类真菌中重要基因的功能鉴定和代谢产物的合成产生了很大的阻碍。CRISPR-Cas9技术是近年来发展起来的重要的基因编辑方法之一,有着效率高、操作便捷等多种优点,但在蘑菇类真菌中尚还没有研究性报道。在本文中,利用CRISPR-Cas9技术在灵芝这种重要的药用蘑菇类真菌中建立了基因中断方法,通过将灵芝密码子优化的cas9基因转入灵芝细胞使其正常表达,再通过体外gRNA转录的方式将gRNA转入含有Cas9的灵芝菌株中,使得灵芝ura3基因产生双链断裂,诱导菌株发生非同源性末端的修复(NHEJ)从而在缺口处引入碱基的缺失或插入,在灵芝260125和5.616两种菌株中诱导产生了ura3中断菌株;同时研究发现gRNA加入量的提高可以ura3中断的效率,可以从10~7个原生质体中得到2个基因中断的突变菌株。为了可以利用CRISPR-Cas9技术中断其他功能基因以进一步推广这种技术的应用,本文探索了基于CRISPR技术的同源重组在灵芝中的可行性;同时为了更好的促进同源重组的发生,本研究通过序列比对的方式在灵芝中找到了可以驱动gRNA内源转录的U6 small nuclear RNA(U6 snRNA)启动子。本文中的基因中断方法是首次在蘑菇类真菌中建立的以CRISPR-Cas9系统为基础的基因中断技术,同现有应用的基因中断技术相比,具有操作便捷、适用性强等优点,可以在通过传统的同源重组方法无法实现的菌株中进行基因中断,这项研究为蘑菇类真菌的遗传改造提供了借鉴,也为其代谢途径的研究奠定了基础。