前言 目前，颈淋巴结转移和肿瘤局部复发是影响喉癌预后的最主要因素。提高喉癌转移的早期诊断水平是及时正确处理颈部转移病灶的关键，有益于提高临床治愈率。以往单独靠体检触摸来判断颈淋巴结转移所造成的失误时有发生。CT及其他影像学检测手段的出现虽已表现出极大的优越性，但是仍然无法在术前准确判断颈淋巴结是否存在隐匿性转移。人们试图利用分子生物学手段寻找一种能够判断肿瘤转移潜力及影响转移的相关因素的方法。近十年人们发现血管生成因子对血管生成的作用以及后者对肿瘤生长和转移的影响。肿瘤细胞或其宿主细胞间质的各种细胞能产生多种肿瘤血管生成因子(TAF)，其中血管内皮生长因子(VEGF)的作用最为重要。VEGF是已知最强烈的直接激活血管生成蛋白质，是可溶性血管内皮细胞促有丝分裂素和血管形成因子，并能增加血管通透性。异常的VEGF表达使血管生成急剧增加，导致肿瘤进展且促进转移发生。研究肿瘤血管生成因子和肿瘤的血管生成，对于早期诊断、预测肿瘤转移和判断预后具有十分重要的意义。目前大多应用的免疫组织化学方法对类似微转移小病灶进行诊断有很大的局限性。伴随分子生物学和分子遗传学的发展，诞生了许多可以弥补传统组织化学方法缺陷的新技术，如逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，它能从mRNA分子水平半定量检测少量的癌细胞样品(能在1000万至1亿个背景细胞中检测出一个表达瘤标志的细胞)，敏感性高特异性强。藉此可预测肿瘤转移倾向或对微小病变进行诊断。免疫组化和RT-PCR联合应用，可对某一待测基因同时从蛋白和分子两种水平的表达情况进行检测，从而更好的认识和阐明该基因的作用机制。迄今为止，尚未见有关VEGF、血管生成与喉鳞癌颈淋巴结转移间关系方面的研究报道。本实验采取以上两种实验方法对VEGF在喉鳞癌组织中的表达情况进行研究。同时，应用彩色病理多成像分析系统（cloud multiple image analysis system，CMIAS）对喉鳞癌组织中的微血管密度（dcrovessel Density，MVD）进行了半定量测定，探讨VEGF的表达与微血管生成的关系，喉鳞癌微血管生成与颈淋巴结转移的关系，以及三者之间的关系及临床意义。 实验材料 收集中国医科大学附属第一临床学院和辽宁省肿瘤医院2001．9－222．2年间手术切除的新鲜喉癌组织标本共60份。其中声门上型喉癌伴颈淋巴结转移20例（第一组X不伴颈淋巴结转移20例（第二组h声门型喉癌不伴颈淋巴结转移20例（第三组人组织学类型全部为鳞癌。颈淋巴结转移通过术中冰冻病理切片证实。所有患者术前均未接受放疗或化疗。术中喉离体后马上切取癌灶中心部分，大小约0．5x0．5x0．scms，放人1．smLEPPendorf管中，立即置人一179℃液氮中速冻，并转人一80℃深冻冰箱中保存备用。 实验方法 本实验在蛋白和分子两种水平上用免疫组织化学和逆转录一聚合酶链式反应（RT－PCR）两种实验手段在三组标本中检测VEGF的表达情况。用免疫组化的方法对三组标本切片行CD31染色，对其结果应用数码相机采集图像，CMIAS计数 MVD。VEGF和CD31染色均采用两步法。所有切片均进行显微照相，记录结果。VEGF的表达以阴性或阳性表示。MVD计数参照Weidner法。全部数据均用SPSS统计分析软件10．0版本进行相关统计分析，P叩．05有统计学意义。 ·2· 结 果 RTj－ PCR检测结果：第一组 VEGFmRNA阳性表达 12例，阳性率60％；第二组阳性表达3例，阳性率15％；第三组阳性表达4例，阳性率20％。第一组与第二组，第一组与第三组分别比较，其结果差异具有显著性意义（P＜o．01’，’，P＜o．01‘。勺；第二组与第三组相比较，结果无统计学意义河＞0．9‘’勺。免疫组化检测结果：第一组VEGF阳性表达13例，阳性率65％；第二组阳性表达4例，阳性率20％；第三组阳性表达5例，阳性率25％；第一组与第二组，第一组与第三组分别比较，其结果差异具有显著意义u＜o．os‘’‘P＜0对互”勺。第二组与第三组相比较，结果无统计学意义口＞0．5‘，＼。＊＊D计数：第一组癌组织的＊＊D平均为门4．859。4．926）什Inln，第二组癌组织的 MVD平均为（6．585。2．550）什mm‘，第三组癌组织的MVD平均为＊．5。2．819）什rum’，颈淋巴结转移阳性的癌组织中＊＊D计数显著增加（P＜O．0005人免疫组化结果显示60例喉癌标本中VEGF为阳性表达的共22例，平均 MVD为门5．397。5．487）～毗；VEGF阴性者 38例，平均 MVD为门．392。3．20 8）什mm‘，VEGF表达和瘤内 MVD有良好的相关性（r＝0．9464，P＜0．025）。 讨 论 VEGF是根据其促血管内皮细胞有丝分裂的活性而命名为血管内皮生长因子。因同时具有增加血管通透性作用，亦称血管通透因子门PF人VEGF是对血管生长有诱导作用的众多生长因子中作用强、特异性高的唯—一种以特异的旁分泌方式作用于血管内皮细胞?