17β-E2通过GPER/PI3K/AKT通路调节小鼠M3T3成骨细胞线粒体自噬的研究

来源 :中国医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xzh19870715
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目的:骨质疏松作为最常见的骨疾病,在全球范围内有已有成千上百万的患者,消耗了大量的医疗资源及严重影响了患者生活质量。骨质疏松的进展受多种因素影响,最重要的因素是随年龄雌激素下降引起的骨流失,既往研究表明雌激素可以与其组织特定受体(ER)-α和(ER)–β结合阻止骨的重吸收,增加破骨细胞凋亡。然而,骨质疏松及成骨细胞寿命缩短与雌激素缺乏间的机制仍不明确。这篇文章主要研究线粒体自噬,线粒体通过多种作用调节线粒体稳态。在此项研究中,我们旨在研究雌激素通过GPER/PI3K/AKT通路引起小鼠成骨细胞M3T3细胞线粒体自噬继而阐明其分子机制。方法:体外培养小鼠成骨细胞M3T3,应用实时定量PCR检测小鼠成骨细胞GPER mRNA的表达情况。Western-blot技术检测小鼠成骨细胞GPER蛋白磷酸化水平。分别加入浓度梯度17β-E2和/或GPER特异性抑制剂G15和/或PI3K特异性拮抗剂(LY294002)进行干预,Western-blot技术检测细胞GPER蛋白表达及AKT总蛋白及磷酸化蛋白水平和线粒体自噬相关蛋白(Hsp60、TOM20、LC3-II)活性变化,同时通过免疫荧光印证了线粒体自噬相关蛋白(Hsp60、TOM20)的变化。结果:1、17β-E2增强M3T3细胞内GPER基因表达及蛋白活性。实时定量PCR及Western-blot技术检测到17β-E2(10-7M,10-8M,10-9M)能够升高GPER mRNA和磷酸化蛋白的水平,且10-7M组具有统计学意义(P<0.05)。当预处理GPER蛋白特异性抑制剂G15后,GPER的活性被抑制,GPER m RNA的表达被抑制,具有统计学意义(P<0.05)。2、17β-E2增强M3T3细胞内线粒体自噬相关蛋白Hsp60、TOM20、LC3-II活性。Western-blot检测显示,10-77 M 17β-E2处理组Hsp60、TOM20、LC3-II蛋白的活化水平增强,且有统计学意义(P<0.05)。3、17β-E2通过GPER/PI3K/AKT通路影响M3T3细胞内线粒体自噬相关蛋白Hsp60、TOM20、LC3-II蛋白活性。Western-blot检测显示,10-7M17β-E2处理组AKT蛋白活化水平增加,且有统计学意义(P<0.05)。Western-blot检测显示,G15、LY294002或和10-77 M 17β-E2联合处理组Hsp60、TOM20、LC3-II蛋白活性被抑制(P>0.05)。结论:雌激素作用M3T3,通过其受体GPER介导了P13K/AKT信号通路的活化,引起线粒体自噬相关蛋白表达增加,通过以上分子机制干预骨质疏松进展。
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