背景与目的：珠蛋白生成障碍性贫血(thalassemia)是由于珠蛋白(globin)基因发生缺失或点突变等，使某种珠蛋白肽链合成受到抑制，导致珠蛋白肽链之间不平衡所引起的一组遗传性溶血性贫血，是世界上发病率最高的单基因遗传病，其中β-珠蛋白生成障碍性贫血在我国南方数省发病率较高。在珠蛋白生成障碍性贫血的治疗上，输血、离子螯合剂、骨髓移植和基因治疗等治疗方案虽然都有一定的疗效，但又都存在不同的缺陷。目前倍受人们关注的γ-珠蛋白基因诱导剂如丁酸盐、羟基脲、促红细胞生成素、曲古抑菌素A、地西他滨、氯化高铁血红素等可诱导出生后近乎关闭的γ-珠蛋白基因重新表达，合成胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin，HbF)(α2γ2)以代替成人血红蛋白(adult hemoglobin，HbA)(α2β2)的不足，从而改善患者的临床症状，但它们又面临着自身的细胞毒性、远期致癌作用或半衰期较短等问题。因此，迫切需要发掘一些新的激活γ-珠蛋白基因的药物。　　 发掘和设计更合理新药的前提是阐明药物激活γ-珠蛋白基因重新表达的机制。虽然已经报道了γ-珠蛋白基因诱导剂可通过活化p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)等途径诱导γ-珠蛋白基因重新表达，但为什么p38MAPK信号途径激活后可诱导γ-珠蛋白基因表达尚不清楚。另外，Ikuta等研究发现对丁酸盐类药物治疗有效的病人γ-珠蛋白基因启动子区DNA序列与核蛋白的相互作用发生了改变，提示转录因子在丁酸盐类药物对γ-珠蛋白基因激活中可能起重要作用，但哪些转录因子与γ-珠蛋白基因表达有关尚不清楚。cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)和激活转录因子-2(activating transcription factor2，ATF-2)属于ATF/CREB转录因子家族成员，是p38MAPK信号通路的下游调节因子，而丁酸钠可以活化p38MAPK信号途径并诱导Gγ-珠蛋白基因的重新表达已有诸多报道；GATA结合蛋白-1/珠蛋白转录因子-1(GATA binding protein-1/globin transcription factor-1，GATA-1)是GATA蛋白家族成员之一，GATA-1在造血干细胞(hematopoieticstem cells，HSCs)和多系祖细胞转换点被激活，高水平的GATA-1活性是珠蛋白基因表达和红细胞成熟所必需的。因此，深入阐明γ-珠蛋白基因诱导剂诱导γ-珠蛋白基因重新表达的分子机制，特别是探索CREB、ATF-2、GATA-1等转录因子的作用是十分必要的。　　 基于以上研究结果和我们课题组以前的研究也证明了p38MAPK信号途径中磷酸化的p38有直接的诱导γ-珠蛋白基因表达的重要作用。本研究的目的是在建立选择性p38持续高磷酸化、低磷酸化和各种对照K562细胞模型的基础之上，进一步分析不同状态的K562细胞核蛋白与γ-珠蛋白基因启动子区特定DNA序列相互作用变化的差异，筛选并鉴定与丁酸钠通过p38MAPK信号途径诱导γ-珠蛋白基因表达相关的转录因子。为深化对转录因子在γ-珠蛋白基因激活中作用的认识，阐明γ-珠蛋白基因表达的分子调控机制提供新的科学依据，为开发新药提供新的分子靶点。　　 方法：①细胞模型的建立和鉴定：选择在多种诱导因素下具有向红系分化能力的人红白血病细胞系K562细胞作为研究对象。通过脂质体介导将pCDNA3.1质粒、pCDNA3.1-MKK3(Glu)[含可选择性持续激活p38的丝裂原活化蛋白激酶激酶-3(mitogen-activated protein kinase kinase-3，MKK3)突变体MKK3(Glu)]和pCDNA3.1-MKK3(Ala)[含可选择性使p38低磷酸化的MKK3突变体MKK3(Ala)]重组质粒转染K562细胞，G418筛选抗性克隆，采用PCR、RT-PCR和Western blotting等方法检测目的基因的整合和表达、p38的表达和磷酸化水平，建立选择性p38持续高磷酸化和低磷酸化的细胞模型[分别称为K562-MKK3(Glu)细胞和K562-MKK3(Ala)细胞)]及转染pCDNA3.1空质粒的对照细胞模型K562-vect细胞。参照文献报导和我们以往研究的经验，选择用0.5mmol/L丁酸钠诱导72h的K562细胞作为药物诱导的细胞模型(丁酸钠+K562细胞)；选择100μmol/L羟基脲诱导72h的K562细胞作为阳性对照细胞模型(羟基脲+K562细胞)。同时设立K562亲本细胞、p38特异抑制剂SB203580(10μmol/L)处理1h后0.5mmol/L丁酸钠诱导72h的K562细胞(SB+丁酸钠+K562细胞)和SB203580(10μmol/L)处理1h的K562-MKK3(Glu)细胞(SB+K562-MKK3(Glu)细胞)作为阴性对照细胞模型。采用RT-PCR、Westernbotting和联苯胺染色等方法对不同状态的K562细胞模型中p38的表达和磷酸化水平、γ-珠蛋白基因和胎儿血红蛋白的表达及联苯胺染色阳性细胞进行鉴定。②不同状态的K562细胞对外源性Gγ-珠蛋白基因启动子活性的影响：登录转录起始位点资料库(Database of Transcriptional Start Site，DBTSS)网站(http：//dbtss.hgc.jp/index.html)查找Gγ-珠蛋白基因启动子序列。利用分子克隆技术，克隆Gγ-珠蛋白基因启动子序列(-1350～+36)并构建荧光素酶报告基因重组质粒pGL3-Gγ，经脂质体介导将其转导入不同状态的K562细胞，以含人单纯疱疹病毒胸苷激酶(human simplex virus-thymidine kinase，HSV-TK)启动子并可表达海肾荧光素酶(Renilla luciferase)的phRG-TK质粒为内对照，通过双荧光素酶报告基因分析系统检测不同状态的K562细胞对外源性Gγ-珠蛋白基因启动子活性的影响。③EMSA探针的设计与合成：选取Gγ-珠蛋白基因启动子区转录因子(transcription factor，TF)富集区寡核苷酸序列作为电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)探针序列，生物素标记的双链DNA探针和同序未标记的双链DNA探针均由美国集成DNA技术(IntegratedDNA Technologies，IDT)公司合成。④转录因子的筛选、鉴定：提取不同状态细胞模型核蛋白并定量后，通过EMSA、super-EMSA等方法筛选鉴定K562-MKK3(Glu)细胞和丁酸钠诱导的K562细胞中与Gγ-珠蛋白基因表达相关的转录因子。提取不同状态细胞模型总蛋白并定量后，通过Western blotting进一步验证有关转录因子的表达和磷酸化水平。　　 结果：①转基因细胞模型的建立：以脂质体介导将pCDNA3.1、pCDNA3.1-MKKa(Glu)和pCDNA3.1-MKKa(Ala)真核表达重组质粒转染K562细胞后，PCR、RT-PCR和Western blotting结果显示：含目的基因的质粒DNA已经稳定整合入K562细胞基因组中。与K562亲本细胞和K562-vect细胞相比，K562-MKK3(Glu)细胞(F=439.816，P=0.000<0.01)和K562-MKK3(Ala)细胞(F=583.734，P=0.000<0.01)中均稳定高表达MKK3；尽管K562-MKKa(Glu)细胞和K562-MKK3(Ala)细胞中p38在mRNA和蛋白水平表达没有明显变化，但K562-MKK3(Glu)细胞中p38磷酸化水平显著升高(约为K562-vect细胞的4.5倍；F=1284.587，P=0.000<0.01)，而K562-MKK3(Ala)细胞中p38磷酸化水平降低(约为K562-vect细胞的0.7倍；F=1129.629，P=0.000<0.01)。SB+K562-MKK3(Glu)细胞中p38的磷酸化又降低至K562亲本细胞水平。建立了选择性p38持续高磷酸化和低磷酸化的细胞模型(分别称为K562-MKK3(Glu)细胞和K562-MKK3(Ala)细胞)及转染pCDNA3.1空质粒的对照细胞模型K562-vect细胞。②药物诱导细胞模型的建立：参照文献报导和我们以往研究的经验，选择0.5mmol/L丁酸钠诱导72h的K562细胞(丁酸钠+K562细胞)作为药物诱导的细胞模型；选择100μmol/L羟基脲诱导72h的K562细胞(羟基脲+K562细胞)作为阳性对照细胞模型。结果显示：与K562亲本细胞相比，丁酸钠+K562细胞和羟基脲+K562细胞中p38在mRNA和蛋白水平表达没有明显变化，但丁酸钠+K562细胞和羟基脲+K562细胞中p38磷酸化水平显著升高(分别约为K562亲本细胞的4.2和3.9倍；F=4782.087，P=0.000<0.01)，而SB+丁酸钠+K562细胞中p38磷酸化又重新降低至K562亲本细胞水平。成功建立了药物(丁酸钠和羟基脲)诱导的p38高磷酸化的细胞模型。③不同状态K562细胞模型的进一步鉴定：RT-PCR、Western blotting和联苯胺染色结果显示：与K562亲本细胞和K562-vect细胞相比，K562-MKK3(Glu)细胞、丁酸钠+K562细胞和羟基脲+K562细胞中Gγ-珠蛋白(分别约为K562-vect细胞或K562亲本细胞的1.4、1.4和1.5倍；F=1815.733，P=0.000<0.01)和胎儿血红蛋白表达(分别约为K562-vect细胞或K562亲本细胞的3.5、3.4和3.5倍；F=9164.470，P=0.000<0.01)及联苯胺染色阳性细胞(分别约为K562-vect细胞或K562亲本细胞的10.5、11.3和10.5倍；F=3624.630，P=0.000<0.01)显著增加，K562-MKK3(Ala)细胞中Gγ-珠蛋白(约为K562-vect细胞的0.8倍；P=0.000<0.01)和胎儿血红蛋白表达(约为K562-vect细胞的0.4倍；P=0.000<0.01)及联苯胺染色阳性细胞(约为K562-vect细胞的0.6倍；P=0.000<0.01)降低。SB+K562-MKK3(Glu)细胞中Gγ-珠蛋白和胎儿血红蛋白表达及联苯胺染色阳性细胞均又重新降低，基本恢复至K562亲本细胞水平(抑制率分别为：102.12％、100.48％和84.35％)；而SB+丁酸钠+K562细胞中Gγ-珠蛋白和胎儿血红蛋白表达及联苯胺染色阳性细胞也均有明显较降低(抑制率分别为：56.43％、60.94％和71.3％)，即仍维持较高水平。这些细胞膜型的建立为后续实验奠定了基础。④不同状态K562细胞对外源性Gγ-珠蛋白基因启动子活性的影响：荧光素酶报告基因实验结果显示：与K562亲本细胞和K562-vect细胞相比，K562-MKK3(Glu)细胞和丁酸钠+K562细胞中荧光素酶活性显著增加(相对活性分别约为K562-vect细胞或K562亲本细胞的2.4和2.8倍；F=546.211，P=0.000<0.01)，而K562-MKK3(Ala)细胞中荧光素酶活性降低(相对活性约为K562-vecr细胞的0.7倍；P=0.000<0.01)。在K562-MKK3(Glu)细胞中荧光素酶活性可被p38特异抑制剂SB203580抑制(抑制率为：99.32％)，而在丁酸钠+K562细胞中p38特异抑制剂SB203580仅部分抑制荧光素酶活性(抑制率为：59.59％；P=0.000<0.01)。说明不同状态的K562细胞激活外源性Gγ-珠蛋白基因启动子能力不同。⑤转录因子的筛选和鉴定：EMSA和super-EMSA实验结果显示：在丁酸钠通过p38MAPK途径诱导Gγ-珠蛋白基因表达中CREB、ATF-2和GATA-1可与Gγ-珠蛋白基因启动子区特异DNA序列相结合，其中CREB和ATF-2与Gγ-珠蛋白基因启动子区特异DNA序列的结合可被p38特异抑制剂SB203580抑制，而p38特异抑制剂SB203580不能完全抑制GATA-1与Gγ-珠蛋白基因启动子区特异DNA序列的结合。Western blotting结果显示：不同状态K562细胞模型中总CREB(F=0.687，P=0.663>0.05)和ATF-2(F=0.832，P=0.564>0.05)表达没有变化，但在K562-MKK3(Glu)细胞和丁酸钠+K562细胞中CREB(分别约为K562-vect细胞或K562亲本细胞的3.4和3.2倍；F=4051.126，P=0.000<0.01)和ATF-2(分别约为K562-vect细胞或K562亲本细胞的2.5和2.9倍；F=5721.138，P=0.000<0.01)磷酸化水平显著增加，并且可被p38特异抑制剂SB203580抑制。丁酸钠+K562细胞中总GATA-1的表达水平显著高于其它细胞模型(约为K562亲本细胞的1.9倍；F=7024.656，P=0.000<0.01)，K562-MKK3(Glu)细胞和丁酸钠+K562细胞中GATA-1磷酸化水平显著增加(分别约为K562-vect细胞或K562亲本细胞的3.9和5.1倍；F=4028.713，P=0.000<0.01)，但K562-MKK3(Glu)细胞中GATA-1磷酸化可被p38特异抑制剂SB203580抑制(抑制率为：99.58％)，而在丁酸钠+K562细胞中p38特异抑制剂SB203580仅部分抑制GATA-1磷酸化(抑制率为：62.17％；P=0.000<0.01)。与K562亲本细胞和K562-vect细胞相比，K562-MKK3(Ala)细胞中CREB、ATF-2和GATA-1磷酸化水平均显著降低(分别约为K562-vect细胞的0.2、0.6和0.5倍；P=0.000<0.01)。　　 结论：①成功建立了 p38持续高磷酸化和低磷酸化的K562细胞模型，进一步证实了p38MAPK信号途径的激活在药物诱导γ-珠蛋白基因重新表达中起重要作用。②首次证明了丁酸钠通过p38MAPK诱导γ-珠蛋白基因表达时核蛋白与γ-珠蛋白基因启动子区特定DNA序列相互作用增强。③首次揭示了丁酸钠通过p38MAPK信号途径诱导γ-珠蛋白基因表达的相关转录因子有CREB、ATF-2和GATA-1。这些转录因子在丁酸钠通过p38MAPK信号途径激活γ-珠蛋白基因重新表达中起重要作用。④转基因细胞模型结果提示通过p38MAPK信号途径诱导γ-珠蛋白基因重新表达中CREB、ATF-2和GATA1的活化与p38MAPK途径的激活密切相关。⑤丁酸钠诱导的细胞模型结果提示丁酸钠通过p38MAPK信号途径激活γ-珠蛋白基因重新表达中CREB和ATF-2的活化与p38MAPK途径的激活密切相关；GATA-1的活化除与p38MAPK途径的激活有关外，可能还涉及到其它的机制，有待进一步研究。⑥本研究结果为阐明γ-珠蛋白基因表达的分子调控机制提供了新的科学依据，为开发新药提供了新的分子靶点。