研究背景不孕不育一直是困扰全世界的医学难题,在不孕不育的夫妻中,男性因素约占50%,而夫妻双方因素仅占20%。其中,世界卫生组织将男性不育定义为：夫妇同居1年以上,在未采用任何避孕措施的条件下,由于男方因素造成女方不孕者,称为男性不育。近年来研究发现男性不育已成为影响人们生活质量的重大疾病之一,其发病率近年来出现了明显的增长趋势。目前研究发现影响男性不育发生的原因较多,包括环境毒物、内分泌功能紊乱、生殖道炎症、射精障碍、营养不育、精索静脉曲张、隐睾、生精管道梗阻及遗传缺陷(基因突变及染色体异常)等。其中,各种病因导致的无精子症是影响男性不育的重要因素之一。依据无精子症发生的病理学改变,目前主要分为两大类,一类是由于睾丸本身原因引起的生精功能障碍,如染色体异常及基因突变、内分泌紊乱等导致的睾丸生精功能障碍,使正常精子的发生受阻,造成男性不育,称为非梗阻性无精症。另一类类是睾丸的生精功能正常,但输精管道发生梗塞,导致正常精子不能排出体外而引起不育,称为梗阻性无精症。然而,目前无精症患者的治疗方法及效果并不令人满意。患者为了明确不育的病因及病理,往往需要接受多次精液分析、常规前列腺液检查、内分泌检查、多普勒超声检查、甚至睾丸活检和染色体核型分析等,这些检查方法耗时长,花费较大,有时候仍不能获得明确的诊断,多数不育患者最终只能选择人工辅助生殖技术。显然,无精子症临床诊断方式的突破及治疗方法的改善有赖于基础研究的重大进展,有赖于无精症发生机制的阐明。近年来研究发现遗传性因素是导致男性不育的重要原因之一,大约有15%的男性不育症是由于遗传性因素引起,包括染色体异常和单基因突变,其中染色体异常占2%-8%,平均为5%。Y染色体微缺失是导致精子发生障碍,引起男性不育的一个重要病因,1976年Luciiano Tiepolo和Orsetta Zuffardi首先提出与精子生成障碍密切相关的Y染色体长臂上无精子症因子概念；1998年Vogt进一步将无精子症因子定位于Yqll,称这种缺失为Y染色体微缺失。无精子症因子由近至远包含3个不同的亚区：位于Yq11.21的AZFa,,位于Yq11.23的AZFb和AZFc。同时,近年研究发现X常染色体易位、基因的突变或缺失也是导致男性不育的重要因素,其中AR, SOX3, USP26, NXF2, TAF7L, FATE及AKAP4等位于X染色体的基因已被证实与精子的发生障碍密切相关。PGAM1为PGAM家族成员之一,与PGAM2高度同源,然而,由于PGAM1具有较多的基因拷贝数,因此把PGAM1作为PGAM2的祖基因。PGAM1是糖酵解途径中的重要酶之一,主要催化3-磷酸甘油酸生成2-磷酸甘油酸,最终成为磷酸烯醇式丙酮酸。目前相关研究发现PGAM1表达于正常的脑、肝及肾等组织,其表达与多种恶性肿瘤的发生相关。然而,其表达与男性不育的研究尚未曾报道过。我们课题组在前期研究工作中发现PGAM1蛋白可能为与男性不育相关的新型候选蛋白,为进一步研究PGAM1表达与男性不育的关系,我们开展了本研究。目的1.探讨PGAM1在人不同类型睾丸组织中的表达及其临床意义。2.探讨PGAM1在生精功能不良动物模型中的表达及其意义。3.探讨PGAM1的生物学功能及相关作用机制。方法1.收集40例不同组织学类型的睾丸组织(生精功能正常10例,轻度生精功能不良10例,重度生精功能不良10例,唯支持细胞综合征10例),经固定、脱水制成石蜡组织块,采用免疫组化检测PGAM1在不同组织学类型睾丸组织中的表达情况,并分析PGAM1表达与临床病理参数的关系。2.收集8例不同组织学类型的新鲜睾丸组织标本(生精功能正常2例,轻度生精功能不良2例,重度生精功能不良2例,唯支持细胞综合征2例),经组织研磨提取RNA,采用qRT-PCR定量检测PGAMmRNA表达水平,并分析其表达与临床病理特征的关系。3.挑选10只6W大的C57雄性小鼠,体重约为19-21g,随机分为实验组及对照组。其中,实验组采用白消安(30 mg/kg)及二甲基亚砜(DMSO)进行腹腔单次注射,构建生精功能不良的C57动物模型,对照组仅注射等体积的DMSO。注射后2w,全部处死小鼠,收集小鼠睾丸组织。睾丸组织经脱水、包埋做成石蜡组织。石蜡组织经切片、脱水及脱蜡后行苏木素-伊红(HE)染色,观察睾丸组织的形态学改变。同时,通过qRT-PCR及Western blot检测实验组及对照组睾丸组织中PGAM1的表达情况,分析睾丸生精功能与PGAM1表达的关系。4.首先通过qRT-PCR检测PGAM1mRNA在小鼠精原细胞株GC1、小鼠精母细胞株GC2及支持细胞株TM4中的表达水平,然后通过siRNA干扰技术瞬时转染敲低GC1及TM4中PGAM1mRNA的表达水平,并通过qRT-PCR及Western blot进行验证。5.通过MTT实验分别检测PGAM1表达下调对GC1及TM4细胞增殖能力的影响；通过流式细胞仪分别检测PGAM1表达下调对GC1及TM4细胞凋亡的影响；通过划痕实验分别检测PGAM1表达下调对GC1及TM4细胞运动能力的影响。6.采用免疫组化及Western blot检测PGAM1表达下调后下游凋亡相关蛋白Caspase 6及caspase 9、抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平,初步探讨PGAM1的分子机制。结果1.免疫组化检测PGAM1在不同组织学类型睾丸组织中的表达免疫组化检测结果表明PGAM1阳性表达于生精功能正常的睾丸组织,主要定位于精原细胞、精母细胞及支持细胞的胞核及胞质中,而精子细胞中无明显阳性表达。其中,在40例不同类型睾丸组织中,PGAM1在生精功能正常、轻度生精功能不良、重度生精功能不良及唯支持细胞综合征中的高表达率分别为90%(9/10),80%(8/10),10%(1/10),100%(10/10),组内比较,差异具有明显统计学意义(P=0.000)。然而,其表达与患者的年龄、睾丸体积、FSH、LH及T水平均无明显相关(P>0.05)。2. qRT-PCR检测PGAM1在不同类型睾丸组织中的表达为进一步探讨PGAM1表达与睾丸生精功能的关系,我们通过qRT-PCR定量检测了PGAM1在生精功能正常、轻度生精功能不良、重度生精功能不良及唯支持细胞综合征睾丸组织中的表达水平,结果提示PGAM1mRNA水平在生精功能正常睾丸组织中的表达明显高于重度生精不良,差异具有统计学意义(P=0.000)。结果也显示PGAM1mRNA水平与患者的年龄、睾丸体积、FSH、LH及T水平均无明显相关(P>0.05)。3. PGAM1在生精功能不良动物模型中的表达为验证白消安单次腹腔注射后,是否能影响睾丸的生精功能,我们通过HE染色观察了实验组与对照组睾丸的形态学改变。结果所示,对照组睾丸组织中的生精小管结构清晰,生精小管内生精细胞的排列及层次整齐,可见到大量成熟的精子集中于生精小管的中间管腔,提示DMSO注射并没有影响睾丸的生精功能；与对照组相比,我们发现在经白消安注射后的实验组小鼠睾丸组织中,生精小管发生明显的变形,并出现萎缩,生精小管内生精细胞排列紊乱,各级生精细胞(精原细胞、精母细胞、精子细胞及精子)均明显减少,提示经白消安注射后睾丸组织出现了明显的生精功能不良,睾丸生精功能不良的小鼠动物模型构建成功。随后,我们通过免疫组化检测了PGAM1的表达情况,结果显示PGAM1在生精功能正常的睾丸组织中阳性表达于生精小管中的精原细胞、精母细胞、精子细胞及支持细胞的胞核及胞浆,同时也阳性表达于间质细胞的胞核及胞浆。然而,PGAM1在生精功能低下的睾丸生精小管中的表达明显减弱。qRT-PCR定量检测结果显示PGAM1在生精功能不良的睾丸组织中的表达明显低于对照组生精功能正常的睾丸组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。同时,Western blot定量检测结果也显示PGAM1在生精功能不良的睾丸组织中的表达明显低于对照组生精功能正常的睾丸组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。4. PGAM1表达下调对GC1及TM4生物学功能的影响首先,我们通过qRT-PCR定量检测了PGAM1在小鼠精原细胞株(GC1)、小鼠精母细胞株(GC2)及小鼠支持细胞(TM4)中的表达情况,结果显示PGAM1在GC1及TM4细胞株中的表达高于GC2。细胞免疫组化结果显示PGAM1在GC1、GC2、TM4细胞株中表达主要定位于细胞质,其中PGAM1在GC1及TM4细胞中的阳性表达强于GC2。同时,免疫荧光结果也表明PGAM1主要定位于细胞质,PGAM1在GC1及TM4细胞中的阳性表达强于GC2细胞。随后,为了进一步明确PGAM1的生物学功能,我们采用siRNA干扰技术瞬时转染敲低PGAM1mRNA在GC1及TM4细胞株中的表达水平,依据qRT-PCR实验筛选出干扰效果最佳的干扰片段进行后续实验,并采用Western blot进行验证。结果表明：针对PGAM1表达设计的三条干扰片段在GC1细胞中,下调PGAM1mRNA的水平分别为24.7%、78.0%、32.0%。其中,与对照组相比,干扰片段2的干扰效果最佳,差异明显,具有统计学意义(P=0.000)。在TM4细胞中,三条干扰片段下调PGAM1mRNA的水平分别为11.0%、84.0%、31.3%。与对照组相比,干扰片段2的干扰效果也是最佳,差异明显,具有统计学意义(P=0.000)。为此,我们选择干扰片段2进行后续的研究。随后,我们采用Western blot分别检测了干扰片段2在GC1及TM4细胞中对PGAM1的干扰效果,结果显示经干扰片段2转染后,PGAM1表达明显下调。为探讨PGAM1表达下调对GC1及TM4细胞增殖能力的影响,我们进行了MTT实验。结果表明在GC1细胞中,PGAM1表达下调后细胞的生长曲线较平缓,OD值明显较低,提示PGAM1表达下调后GC1细胞的增殖能力明显减弱(P=0.000)。同时,在TM4细胞中,PGAM1表达下调后,细胞的生长曲线与对照组相比,也较平缓,OD值明显低于对照组,提示PGAM1表达下调后TM4细胞的增殖能力明显减弱(P=0.000)。为探讨PGAM1表达下调对GC1及TM4细胞凋亡能力的影响,我们采用流式细胞仪检测了细胞的凋亡率。结果显示：对照组GC1细胞的凋亡为2.1%±0.5%,而PGAM1表达下调后GC1细胞的凋亡率为11.8%±1.5%,明显高于对照组,差异明显,具有统计学意义(P=0.000)。同时,对照组TM4细胞的凋亡为8.7%±2.4%,而PGAM1表达下调后GC1细胞的凋亡率为18.1%±3.9%,明显高于对照组,差异明显,具有统计学意义(P=0.000)。为探讨PGAM1表达下调对GC1及TM4细胞运动能力的影响,我们进行了划痕实验。结果表明PGAM1表达下调后24h,TM4细胞的迁移距离明显低于对照组,差异具有统计学意义(P=0.000),提示PGAM1表达下调明显抑制了TM4细胞的迁移。然而,PGAM1表达下调后24h,GC1细胞的迁移距离无明显变化,差异无明显统计学意义(P=0.786),提示PGAM1表达下调明对GC1细胞的迁移能力无明显影响。5. PGAM1表达下调对下游凋亡相关蛋白表达的影响为探讨PGAM1发挥生物学功能的潜在机制,我们通过Western blot检测了PGAM1表达下调后,凋亡相关蛋白Caspase 6及Caspase 9的表达情况,同时也检测了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达情况。结果表明,PGAM1表达下调后Caspase 6及Caspase 9表达均出现明显上调,而Bcl-2表达出现明显下调,提示PGAM1的表达下调激活了Caspases及Bcl-2信号通路。结论1. PGAM1阳性表达于生精功能正常的睾丸组织,其表达下调可能引起睾丸生精能力的减弱。2. PGAM1表达与生精细胞的增殖、凋亡及迁移能力相关；其中,PGAM1表达下调能明显抑制GC1及TM4细胞的增殖,也能明显抑制TM4细胞的迁移,同时有助于GC1及TM4细胞的凋亡。3. PGAM1发挥生物学功能的机制与其表达下调激活了Caspases及Bcl-2信号通路有关。