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菠萝(Ananas comosus)是热带多年生草本果树,世界重要热带水果之一。部分菠萝品种叶片边缘常有叶刺,给田间管理和栽培采收带来诸多不便,培育无刺品种是菠萝育种的重要目标之一。本文以菠萝台农16号为试材,基于转录组测序数据获得7 个与菠萝叶刺形成相关的基因:AcBLH2(Ananas comosus BELl-like homeodomain protein 2)、AcLBD15(Ananas cowosus LOB dowain-containing protein 15)、AcKNOX1(Ananas comosus homeotic protein knotted-1-like)、AcSPL14(Ananas comosus squamosa promoter-binding-like protein 14)、AcTBL1 9(Ananas comosus protein trichome birefringence-like 19)、AcWAT1(Ananas comosus protein WALLS ARE THIN 1)和AcWOX3(Ananas comosus WUSCHEL-relatedhomeobox 3-like)。荧光定量进一步分析,在菠萝不同形态的叶缘中存在差异表达的基因有5个:AcBLH2、AcLBD15、AcKNOX1、AcSPL14、AcTBL19。对以上目标基因进行生物信息学分析、表达模式分析,构建过表达载体,转化模式植物拟南芥进行功能鉴定,初步阐明了菠萝叶刺形成相关基因在叶形发育中的作用,主要研究结果如下:1、分别在菠萝有叶刺、无叶刺叶边缘中成功分离7个菠萝叶刺形成相关基因的全长cDNA序列,结果发现这7个基因在不同叶缘中的基因序列几乎无差异,根据NCBI网站上的预测序列名称将其分别命名为AcBLH2、AcLBD15、AcKNOOX1、AcSPL14、AcTBL19、AcWAT1 和 AcWOX3。2、实时荧光定量(qRT-PCR)分析7个菠萝叶刺形成可能相关的基因在菠萝不同品种、不同叶缘中的相对表达量,结果显示在同一品种不同形态的叶缘中表达量显著差异的基因有 5 个:AcBLH2、AcLBD15、AcKNOX1、AcSPL14、AcTBL19,无明显差异的基因有2个:AcWAT1和AcWOX3;AcBLH2、AcLBD15和AcTBL19基因在两个品种无叶刺菠萝叶边缘中相对表达量均显著高于有叶刺菠萝,而AcKNOX1、AcSPL14基因在两个品种无叶刺菠萝叶边缘中相对表达量均显著低于有叶刺菠萝,5个差异基因在两个品种的不同叶缘中表达量差异呈现一致性,表明品种差异不会影响这5个基因在不同形态叶缘的表达量差异。另外,荧光定量分析了 7个相关基因的时空特异性表达,除AcBLH2基因在菠萝叶中表达量最高以外,其它6个基因均在菠萝茎中表达量最高。3、通过对5个差异基因编码的蛋白质进行结构域分析,显示5个基因均具有各自相应基因家族的保守结构域,功能具有一定的保守性。系统进化树分析显示BLH、SPL14基因家族中没有与菠萝亲缘关系较近的物种;KNOX1、LBD15、TBL19基因家族中与菠萝亲缘关系较近的均是海枣。4、成功构建5个菠萝叶刺形成相关基因的过表达载体,并转化模式植物拟南芥,均获得阳性植株,转 35S::AcBLH2、35S::AcLBD15、35S::AcSPL14和 35S::AcTBL19阳性植株叶形与野生型拟南芥均无明显差异,转35::AcKNOX1阳性拟南芥叶面皱缩,部分叶片叶裂加深,叶表皮毛密度明显增大,生长发育后期出现黄化现象。5、采用洋葱内表皮细胞进行亚细胞定位实验,结果表明AcKNOX1定位于细胞核中,推测其可能主要在细胞核中发挥转录因子的调控作用。6、分别在菠萝有叶刺、无叶刺叶边缘中成功获得AcKNOX1基因的启动子,测序结果显示两个启动子核酸序列一致,对其启动子分析发现具有赤霉素、细胞分裂素和脱落酸等多种激素的响应元件,可能调控激素合成途径(响应途径)中相关基因的表达,影响植物生长发育;该基因的启动子还具有光响应元件、厌氧诱导顺式调控元件和环境胁迫响应元件等调控元件,表明AcKNOX1基因可能还参与其它生物学途径。利用赤霉素、细胞分裂素和脱落酸三种激素对菠萝幼苗进行处理,荧光定量分析发现三种激素处理条件下,随着时间的推移,AcKNOX1在菠萝幼苗中的表达量呈现先上升后下降的趋势,且分别在8 h、12 h和12 h相对表达量达到峰值。表明这三种激素均能诱导AcKNOX1基因的表达。本研究从不同叶缘形态的菠萝叶中,成功分离获得7个与菠萝叶刺形成可能相关的基因,初步鉴定只有AcKNOX1基因可能在菠萝叶刺发生中起关键作用;在有叶刺、无叶刺菠萝叶中,AcKNOX1基因差异表达不是其启动子序列差异引起的;外源添加激素处理,可能诱导AcKNOX1基因的表达量升高,从而引起菠萝叶刺的发生。本研究有助于了解菠萝叶形发育的调控机制,为培育菠萝无刺品种奠定基础。