近年来食品安全问题不断,人们渐而不以为奇,甚或一度谈“食”色变。食源性疾病是我国乃至世界范围内的首要食品安全问题,以及公共卫生问题之一,给世界各国带来了难以估量的经济负担和社会影响。在所有食源性疾病致病因素包括微生物因素、化学物理以及有毒动植物因素中,微生物因素是最重要的致病因素,高居第一位;而细菌在微生物中占绝大多数,所以食源性致病菌是我国食品安全和公众健康面临的最根本问题。沙门氏菌是最常见且最重要的致病菌,其血清型众多,是我国细菌性食源性疾病中位居第二位的致病菌。副溶血性弧菌大量分布于世界各地的近海水域,人类大多由于摄入生的或未熟的海产品而致病,其已成为我国乃至亚洲许多国家第一位的食源性致病菌。单核细胞增生李斯特菌可引起致命性的李斯特菌病,其在欧美国家十分常见,近年来在我国市售食品中也频频检出,已成为我国最常见的食源性致病菌之一。对于上述三种致病菌,建立其快速筛查和诊断的方法十分必要。总的来说,食源性致病菌的快速鉴定方法包括免疫学方法、生物传感器技术以及核酸检测。免疫学方法如ELISA、IMS等依赖于抗原抗体的特异结合,抗干扰能力差。生物传感器技术具有低稳定、高成本的缺点。PCR及其衍生技术作为核酸检测的经典代表,在检测灵敏度、稳定性方面都大有增进,但其对专业操作和精密仪器如温度循环仪的依赖使其应用至今仍局限于实验室内,越发难以满足传染病即时诊断的现实需求。核酸恒温扩增技术的出现填补了这一缺憾,这些方法无需热循环,在恒温条件下即可实现核酸序列的特异扩增,从而使核酸检测从实验室走向现场成为可能。LAMP技术,即环介导恒温扩增,是核酸恒温扩增的集大成者。其反应在恒温条件下,仅需一种类型的酶即可实现扩增;扩增反应在60min内完成,且具有高特异性和类似于巢式PCR的灵敏度;快速、连续的LAMP反应成就了其高扩增效率,还可用于RNA的扩增;其结果肉眼可判,也可利用浊度和荧光对其反应进行实时监测。由于LAMP反应结合了以上特点,其自发明以来在各领域都有深入应用,包括病原鉴定、基因诊断、环境样品的快速检测等。LAMP技术的发展似乎已十分完备,但美中不足的是,目前LAMP反应大都局限于单靶标检测,即一次反应只能检测一个目的基因,多重LAMP的发展受到限制。究其原因,大致可归结为一“易”一“难”:一是多重LAMP体系非特异扩增之易;由于LAMP引物为4-6条,多重LAMP体系中引物数量就要数倍于此,引物间交叉反应的几率相应增加,从而导致非特异扩增。二是多重LAMP体系目的基因区分之难;由于LAMP产物大小不等、长短不一,所以多重LAMP无法像多重PCR那样仅通过电泳就可对其体系中的多个目的片段进行区分。这两个因素是制约多重LAMP发展的瓶颈。鉴于以上分析,本研究主要有以下三部分内容:一.副溶血性弧菌、沙门氏菌、单增李斯特菌LAMP检测方法的建立分别以副溶血性弧菌tlh基因、沙门氏菌bcfD基因、单增李斯特菌iap基因为靶序列,设计相应的LAMP引物,Blast序列分析进一步验证引物特异性;综合考虑扩增效率和检测灵敏度,选取最优引物,建立LAMP反应体系。以相近的其他食源性致病菌DNA为模板评价其特异性,以PCR反应为参照判定和评价其检测灵敏度。实时浊度结果显示,扩增可在40min内完成。特异性实验显示,这三种致病菌的LAMP引物均只能扩增其相应的目的基因,而以其他相近致病菌DNA为模板的反应和阴性对照均无扩增出现,表明其高度特异。以PCR反应作为比较的灵敏度实验显示,该法灵敏度好,或具有优于PCR的灵敏度。二.副溶血性弧菌、沙门氏菌和单增李斯特菌多重LAMP检测方法的建立本实验旨在建立能够同时检测副溶血性弧菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的多重LAMP反应体系。引入引物浓度优化的概念和意识,通过考察三种引物浓度组合的多重反应体系对扩增效率的影响,综合考虑检测成本,以确定最佳引物配比,并以此建立多重LAMP反应体系,初步评价特异性和灵敏度。结果显示,减少各LAMP引物浓度为其原浓度的一半(1.3μmol/L),以此建立的含有18条引物的多重LAMP反应体系,在保证扩增效率的同时,又能减小非特异扩增产生的可能。特异性和灵敏度实验表明,当这三种致病菌DNA或之一、或之二、或之三存在时,该多重LAMP都能够将其检测出来,其最低检测浓度与相应的单重LAMP灵敏度是一致的。该方法在某种程度上减少了工作量、节省了成本,适用于大量样品检测时的初步筛查和诊断。三.沙门氏菌和副溶血性弧菌多重实时荧光LAMP检测方法的建立本实验旨在建立一种同时检测并鉴别沙门氏菌和副溶血性弧菌的多重实时荧光LAMP方法,以打破“多重LAMP体系目的基因区分之难”的瓶颈。其方法是在多重LAMP反应体系中加入荧光染料EveGreen,在反应结束后对多重LAMP产物进行熔解曲线分析,依据目的基因LAMP产物熔解温度(Tm值)的不同以同时检测沙门氏菌和副溶血性弧菌,并进行区分。初步评价该实时荧光LAMP的特异性和灵敏度,并研究其定量能力。实验结果显示,沙门氏菌bcfD基因和副溶血性弧菌toxR基因LAMP产物具有相对稳定的Tm值,分别为86.25±0.06℃和84.05±0.06℃;这两个Tm值之间的差异可使二者在多重体系中被区分,在熔解曲线上表现为两个峰值。特异性实验显示,该方法能够扩增全部的沙门氏菌和副溶血性弧菌DNA,且7株沙门氏菌的Tm值统一落在86.5oC-86.8oC之间;表明该方法具有较好的检测特异性。对沙门氏菌和副溶血性弧菌同时检测和鉴别的灵敏度与多重PCR是一致的。该实时荧光LAMP定量能力评价实验表明,模板DNA浓度与反应时间Cq值之间存在线性关系(R2=0.934),表明该法具备基本的定量能力。多重LAMP体系中的优势扩增现象亦在本实验中得到发现和证实,并依据“强”减“弱”增的引物浓度调整原则优化引物浓度,平衡了不均衡扩增。综上所述,本研究针对我国三种重要的食源性致病菌,致力于LAMP检测技术的研究,着力打破制约多重LAMP发展的两大瓶颈;以进一步优化和完善LAMP技术,为食源性致病菌的快速检测提供技术支持,并为多重生物检测技术的发展奠定理论依据。