猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）属于圆环病毒科,圆环病毒属。PCV2感染会引起淋巴细胞减少和组织细胞浸润,从而导致猪的免疫抑制。PCV2基因组是闭合、共价的环状单链DNA,大小为1.7 kb。目前已知PCV2约有11个开放阅读框（open reading frame,ORF）。两种主要的编码蛋白是:orf1基因编码的复制酶相关蛋白Rep和orf2基因编码的衣壳蛋白Cap。另外,orf3基因反向嵌套在orf1基因中,PCV2可能利用ORF3蛋白促进细胞发生凋亡。本实验室前期研究已发现PCV2能通过PERK/eIF2α通路激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）,继而引起细胞凋亡;PCV2通过Cap蛋白经由IP3R-Ca2+途径激活CaMKKp/CaMKI/WIPI1通路诱导细胞自噬。凋亡和自噬与PCV2致病机理有相关性,但仍有一些重要机制有待阐明。本研究的科学问题:（1）PCV2是否诱导线粒体自噬?其诱导机制及其与线粒体凋亡间是否存在联系?（2）PCV2引起线粒体凋亡是否与UPR有关?Ca2+和ROS是否在其中起作用?1.PCV2感染诱导细胞线粒体自噬的机制1)PCV2感染PK-15细胞诱导线粒体自噬为了证明PCV2是否诱导线粒体自噬,利用亚细胞器特异性染料,结合激光共聚焦显微技术,我们发现PCV2感染细胞的GFP-LC3点状聚集与线粒体的共定位显著增加（p<0.01）,线粒体自噬染料Mtphagy Dye荧光和溶酶体染料Lyso Dye荧光强度显著增加（p<0.01）。透射电镜观测到PCV2感染细胞中出现肿胀、空洞和缺乏嵴的线粒体,并且观察到自噬溶酶体包裹线粒体的现象。表明PCV2感染引发线粒体自噬。2)PCV2感染引起氧化应激并激活Drp1和PINK1/Parkin通路共聚焦观测显示PCV2通过促进线粒体分裂蛋白Drp1 Ser616磷酸化,使p-Drp1募集到线粒体。免疫印迹显示PCV2感染细胞的线粒体蛋白组份中p-Drp1量显著高于未感染的对照细胞（p<0.05）。表明PCV2通过Drp1磷酸化及其线粒体易位促进线粒体分裂。已知PCV2感染诱导氧化应激,为了探究PCV2促进Drp1磷酸化是否与其诱导的氧化应激有关,我们收集PCV2感染不同时间点的细胞样品进行免疫印迹和流式细胞术分析。结果表明,p-Drp1和ROS水平随着PCV2感染时间延长的而增加（p<0.05）。N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）处理可有效抑制PCV2感染细胞中的ROS生成,并降低Drp1磷酸化水平,表明ROS参与了Drp1磷酸化（p<0.01）。PCV2感染细胞总蛋白中PINK1和Parkin的表达增加,在线粒体中Parkin的积累也显著增加,说明病毒感染激活PINK1/Parkin通路来诱导线粒体自噬。NAC处理可以抑制PINK1和Parkin表达,并降低Parkin在线粒体组份中的积累,Drp1的磷酸化水平也受到抑制（p<0.05）。NAC处理也显著降低LC3Ⅱ的表达水平以及由PCV2诱导的线粒体与EGFP-LC3点状聚集共定位。表明ROS可能作为Drp1和PINK1/Parkin途径的上游信号,影响线粒体分裂,调节线粒体自噬的发生。3)Drp1调控PCV2诱导的线粒体自噬和线粒体凋亡用慢病毒介导的shRNA（shDrpl）或特异性Drp1磷酸化抑制剂（Mdivi-1）探究抑制Drp1磷酸化是否影响细胞的ROS水平、线粒体稳态和凋亡。我们观察到Mdivi-1或shDrp1处理的PCV2感染细胞中Drp1、p-Drp1和ROS水平显著低于未处理对照组（p<0.05）,并可缓解PCV2感染引起的线粒体膜电位和线粒体质量下降（p<0.05）。Mdivi-1或shDrp1处理可减轻PCV2诱导的凋亡,降低caspase-3和-9活性（p<0.05）。免疫印迹显示,抑制Drpl可降低PINK1表达、减少caspase-3的剪切（p<0.05）、下调线粒体组份中的Parkin积累和LC3Ⅱ/Ⅰ比率。上述结果表明:PCV2诱导线粒体自噬可能与其诱导的氧化应激有关,氧化应激促进Drp1磷酸化,p-Drp1激活PINK1/-Parkin通路,由此引发线粒体自噬。2.PCV2感染线粒体凋亡的机制1)不同基因型PCV2感染细胞的内质网应激和未折叠蛋白反应通过流式细胞术（Flow cytometry,FCM）和TUNEL法,我们发现PCV2b型和PCV2d型毒株感染PK-15和PAM细胞的凋亡比例显著高与未感染的对照细胞（p<0.05）,并引起GRP78、p-PERK、p-eIF2α和 cleaved-caspase 3（C-cas 3）蛋白水平的显著增加（p<0.05）,提示ERS和UPR通路以及caspase-3的激活。2)PCV2通过Ca2+失衡和氧化应激诱导不依赖于ORF3的线粒体凋亡已有报道显示PCV2的ORF3蛋白可以诱导凋亡。我们推测PCV2可能存在不依赖于ORF3引发凋亡,通过定点突变方式将PCV2b-YW（WT）中的ORF3起始密码子失活,构建了PCV2△ORF3（△ORF3）。通过流式细胞术和TUNEL法检测细胞的凋亡比例,发现Δ ORF3感染细胞凋亡率显著高于未感染细胞（p<0.05）,说明PCV2可以通过不依赖于ORF3的方式诱导凋亡。通过免疫印迹检测PERK和eIF2α,我们发现△ORF3依然能激活UPR通路和ERS。通过FCM检测发现,WT和Δ ORF3均能上调胞浆内及线粒体内Ca2+,并且引起ROS上升和MMP下降,这些结果暗示△ORF3可能通过线粒体途径引起凋亡。为了验证Δ ORF3引起的线粒体凋亡是否通过ERS和UPR的激活,PERK磷酸化抑制剂GSK2606414（GSK）及内质网应激缓解剂4-苯基丁酸（4-Phenylbutyric acid,4-PBA）用于抑制PCV2诱导的UPR和ERS激活。这些化学物在显著降低PERK和eIF2α的磷酸化的同时,能显著降低Δ ORF3感染细胞中的caspase-3剪切和细胞凋亡水平（p<0.01）。FCM和共聚焦观测发现,GSK和4-PBA处理可显著降低胞浆内和线粒体内Ca2+以及细胞ROS水平,并缓解MMP的下降（p<0.01）。说明△ORF3所引起的凋亡可能与ERS/UPR激活以及Ca2+和ROS失衡有关。3)PCV2通过Cap蛋白诱导未折叠蛋白反应和线粒体凋亡本研究利用真核表达质粒pCMV-Cap研究Cap蛋白在诱导线粒体凋亡中所起的作用。通过FCM检测发现,Cap蛋白能够显著上调胞浆内和线粒体内Ca2+和 ROS,降低 MMP（p<0.01）,提高 caspase-3 和 caspase-9 的活性。沉默 PERK能抑制Cap蛋白所引起的凋亡,并降低胞浆和线粒体内Ca2+,缓解氧化应激。表明Cap蛋白通过激活UPR导致Ca2+溢出和线粒体稳态失衡,最终诱导线粒体凋亡。综上所述,本研究阐明了:1)PCV2感染引起氧化应激,激活Drp1和PINK1/Parkin通路,诱导线粒体自噬。2)PCV2可以诱导不依赖ORF3的细胞凋亡,PCV2感染或Cap蛋白表达均可通过诱导内质网应激、Ca2+稳态失衡和ROS积累导致线粒体凋亡。本研究结果为进一步探究PCV2的致病机理奠定基础,提示抗氧化药物可作为抗PCV2感染的辅助治疗。