【摘 要】
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结核病（Tuberculosis,TB）是一种古老的疾病,在世界上已经有四千多年的历史,我国的人口基数大,患有结核病的人数较多,迄今为止,结核病仍然是世界上致死率较高的传染病。2019年据世界卫生组织统计,全球共新增了 700万结核病人,目前治疗结核病的一线抗结核药物有利福平、吡嗪酰胺、异烟肼等,但是抗生素的使用让耐药结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）的数
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结核病（Tuberculosis,TB）是一种古老的疾病,在世界上已经有四千多年的历史,我国的人口基数大,患有结核病的人数较多,迄今为止,结核病仍然是世界上致死率较高的传染病。2019年据世界卫生组织统计,全球共新增了 700万结核病人,目前治疗结核病的一线抗结核药物有利福平、吡嗪酰胺、异烟肼等,但是抗生素的使用让耐药结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）的数量增多,难以治疗,并且一线抗结核药物对于肝脏有毒副作用,患者常常难以忍受药物带来的副作用,结核病难以根治以及容易传播是结核病扩散迅速的首要原因。疫苗是防控疾病的有力武器,到目前为止,卡介苗（Bacilli Calmette Guerin,BCG）是全球唯一的预防结核病的疫苗,BCG在早期预防儿童结核病具有较好的临床表现,经研究发现,BCG仅对未成年人有保护作用且保护年限仅有15年;成年人接种BCG并不能够起到预防结核病的作用,开发新的结核病疫苗形势严峻。目前临床开发的主要的疫苗有两种:分枝杆菌全细胞疫苗和亚单位疫苗,BCG对于未成年人的保护效果对于全细胞疫苗的研发具有一定的指导意义。结核病的亚单位疫苗主要是从结核分枝杆菌编码的全蛋白中筛选出结核分枝杆菌的关键抗原蛋白。据统计,结核分枝杆菌标准毒株H37Rv共编码约4000个蛋白,从中筛选出结核分枝杆菌的所有抗原蛋白是一个很大的挑战。结核分枝杆菌PE/PPE家族蛋白是结核分枝杆菌中重要的蛋白家族,该家族中的蛋白大多数定位在结核分枝杆菌的细胞壁,被认为是结核分枝杆菌的主要毒力来源,能够与Toll家族受体相互作用,调节宿主的免疫。PPE10蛋白是结核分枝杆菌PPE家族的蛋白之一,由Rv0442c基因编码,据报道,PPE10蛋白是分枝杆菌的细胞壁组成成分之一。本研究采用Gateway技术构建了 PPE10蛋白表达载体,并将表达载体转入大肠杆菌Rosetta中,成功在大肠杆菌中表达出了 PPE10蛋白,经鉴定,PPE10蛋白为包涵体沉淀,经过尿素溶解和透析获得了纯度为87%的PPE10蛋白,并采用去内毒素试剂盒对蛋白内毒素进行了去除,使其内毒素的含量小于0.1 EU/mL。我们用弗氏不完全佐剂对PPE10蛋白进行乳化,用乳化后的20μg的PPE10蛋白和1×106 CFU的BCG分别免疫小鼠,以单独使用弗氏不完全佐剂免疫的小鼠作为对照。在免疫小鼠3次后折颈处死小鼠,取出小鼠的脾脏并分离脾细胞,再次用PPE10蛋白刺激小鼠的脾细胞,结果发现PPE10蛋白免疫的小鼠的脾细胞再次经过PPE10蛋白刺激后,与对照组相比能够产生更多的γ干扰素、白细胞介素6、白细胞介素2,这三种细胞因子均为Th1型细胞因子,对于调控机体的免疫应答具有重要作用,能够增强机体的免疫系统对结核分枝杆菌的杀伤,说明了 PPE10蛋白是结核分枝杆菌的抗原蛋白之一;另外白细胞介素10的分泌与对照组相比无显著变化,推测白细胞介素10不参与PPE10蛋白的免疫反应。小鼠经PPE10蛋白免疫后,体内可能产生对MTB的保护性免疫反应。小鼠分别经过PPE10蛋白和BCG免疫后,经尾静脉注射结核分枝杆菌标准毒株H37Rv,在4周后统计小鼠肺部的结核分枝杆菌的数量发现,经PPE10蛋白免疫的小鼠比空白对照组小鼠的肺部的持菌量少（p＜0.01）,说明了 PPE10蛋白免疫后的小鼠对于结核分枝杆菌具有更强的抵抗能力。经BCG免疫的小鼠肺部的持菌量比PPE10蛋白免疫的小鼠肺部的持菌量更少（p＜0.01）,可能是因为BCG为分枝杆菌全细胞疫苗,含有许多不同的抗原成分,当结核分枝杆菌标准毒株H37Rv感染小鼠时,结核分枝杆菌的分泌蛋白或细胞壁蛋白能够刺激小鼠的记忆细胞,使小鼠体内产生更强的免疫反应,从而肺部的结核分枝杆菌被免疫系统快速清除,从小鼠肺组织的苏木精-伊红染色结果也可以看出,经过PPE10蛋白免疫的小鼠,肺组织的病理损伤比空白对照组的小鼠肺部组织的病理损伤程度轻。根据本研究可以说明PPE10蛋白在结核分枝杆菌的感染中发挥一定的作用,调节宿主免疫应答,可能成为开发结核病亚单位疫苗的候选蛋白之一。
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