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胃癌目前是世界第二大致死性恶性肿瘤，我国属于高发国家。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H. pylori)是一种革兰氏阴性的微需氧螺旋状杆菌，据估计在全世界总人口中约半数感染，而在我国自然人群中感染H. pylori的比例达到54.76%。目前认为H. pylori感染是引起胃癌的高危因素，1994年被WHO正式列为Ⅰ类致癌因子。临床研究表明H. pylori感染阳性患者发生胃癌的风险要高于H.pylori感染阴性患者，而早期根除H. pylori感染可以降低胃癌发生的风险，但H.pylori感染引起胃癌的机制目前仍不清楚。微小RNAs（microRNA, miRNAs）是近年来发现的一类普遍存在于真核生物中的非编码性、内源性的小分子单链RNA，长约22个核苷酸，具有高度保守性。miRNA主要通过与靶基因mRNA的3’端非编码区域(3’-UTR)结合互补程度调控靶基因的表达，引起靶基因mRNA的降解或者转录后翻译水平的抑制。有52.5%编码miRNA的基因位于肿瘤相关的基因组区域或者脆性位点，提示miRNA与肿瘤的关系密切，现有大量研究证明miRNA的表达在肿瘤的发生、诊断和治疗中起着重要的作用。国外学者研究发现有大约30个miRNA在H. pylori感染阳性和阴性胃粘膜组织中存在显著性低表达，其中miR-375与H. pylori感染的活动性、慢性炎症程度和定植密度均有关联，尤其与慢性炎症程度关系最为密切。而miR-375据研究报道在胃癌组织和细胞中也呈显著性低表达并起着抑癌基因的作用，由此提示miR-375在H. pylori感染和胃癌的形成中起着非常重要的作用。国内学者已证明JAK2是miR-375的靶基因，而过表达的JAK2可以持续激活JAK/STAT3信号通路，后者可以促进炎症和肿瘤的发生发展。我们在miRNA预测靶基因数据库筛查发现，JAK/STAT3信号通路的另外两个调控因子JAK1和STAT3，是miR-106b的可能下游靶基因，而miR-106b在H. pylori感染阳性的胃粘膜组织中也呈显著性低表达，提示H. pylori感染可能对miR-106b的表达有抑制作用。所以，我们提出科学假说：H. pylori感染胃癌细胞一方面通过下调miR-375表达从而增强JAK2的表达水平，另一方面可以通过下调miR-106b表达促使其靶基因JAK1和STAT3的表达增加，最终激活JAK/STAT3信号通路。本研究用H. pylori的毒力因子脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）研究H. pylori感染诱导miRNA在胃癌细胞表达及其调控机制，阐明H. pylori-LPS可以通过抑制miR-375和miR-106b表达，激活JAK/STAT3信号通路从而引起炎症反应和肿瘤恶性转化。本研究结果为研究H. pylori感染引起胃癌发生发展的机制提供新的科学依据和理论基础，也有助于H. pylori感染相关性miRNA成为胃癌诊断、治疗以及预后的新靶点。方法:1. H. pylori-LPS诱导miR-375和miR-106b的表达研究用H. pylori-LPS刺激胃癌AGS和MKN45细胞12小时，实时定量PCR检测胃癌细胞miR-375和miR-106b的表达变化。阻断TLR4受体6小时后，再用H. pylori-LPS刺激胃癌AGS和MKN45细胞12小时，实时定量PCR检测miR-375和miR-106b的表达变化。用Western blotting、实时定量PCR分别检测在H. pylori感染阳性和阴性胃粘膜组织标本，以及在H. pylori-LPS刺激胃癌AGS和MKN45细胞12小时后，Dicer的蛋白和mRNA表达变化。2. H. pylori-LPS调控胃癌细胞miR-375表达的机制研究用Western blotting、实时定量PCR分别在H. pylori-LPS刺激胃癌AGS和MKN45细胞12小时后，Sp1、MDM2和p63的蛋白和mRNA表达水平变化;用Western blotting、实时定量PCR、双荧光素酶报告基因、细胞免疫荧光研究miR-375、Sp1和MDM2之间的关系。用MDM2高表达质粒和MDM2干扰RNA分别研究MDM2、Dicer和p63之间的关系。3. H. pylori-LPS诱导miR-375和miR-106b表达激活JAK/STAT3信号通路的机制研究用Western blotting、实时定量PCR检测H. pylori-LPS刺激胃癌AGS和MKN45细胞12小时， MCM7和JAK2的蛋白或mRNA表达变化。用实时定量PCR检测MDM2高表达作用下miR-106b的表达变化；用Western blotting、实时定量PCR、双荧光素酶报告基因研究JAK1和STAT3是否是miR-106b的调控靶基因。用Western blotting检测H. pylori-LPS作用胃癌AGS和MKN45细胞不同时间点，JAK1、JAK2和STAT3的磷酸化水平变化。结果:1. H. pylori-LPS诱导miR-375和miR-106b的表达研究H. pylori-LPS可以下调miR-375和miR-106b在胃癌AGS和MKN45细胞的表达。阻断TLR4受体，可以扭转H. pylori-LPS对miR-375和miR-106b的抑制作用。H. pylori感染阳性和阴性胃粘膜组织相比，Dicer的蛋白水平表达降低(P <0.05)；H. pylori感染阳性和阴性胃粘膜组织相比，Dicer的mRNA水平表达显著降低(P <0.01)；H. pylori-LPS分别刺激胃癌AGS和MKN45细胞，也可以降低Dicer的蛋白和mRNA表达。2. H. pylori-LPS调控胃癌细胞miR-375表达的机制研究2.1Sp1和MDM2在H. pylori-LPS调控miR-375表达机制中的作用H. pylori-LPS可以上调Sp1和MDM2在胃癌AGS和MKN45细胞的蛋白和mRNA表达水平。分别在胃癌AGS和MKN45细胞转染miR-375inhibitors，可以增强Sp1的mRNA水平；当转染miR-375mimics后，抑制Sp1的mRNA水平(P <0.05)。H. pylori-LPS或者低表达的miR-375均能增强MDM2的启动子活性。H. pylori-LPS可以通过抑制miR-375的表达从而增强MDM2在胃癌细胞的蛋白表达水平。细胞免疫荧光结果也证实低表达的miR-375可以增强MDM2在胃癌细胞的荧光表达。2.2MDM2和Dicer的关系在H. pylori-LPS调控miR-375表达的作用研究转染MDM2高表达质粒后，能降低胃癌细胞Dicer的蛋白水平，而且miR-375的表达水平也降低；而转染MDM2siRNA后，引起Dicer蛋白水平表达增加。H.pylori-LPS和高表达的MDM2均能抑制p63在胃癌细胞的表达。3. H. pylori-LPS诱导miR-375和miR-106b表达激活JAK/STAT3信号通路的机制研究3.1H. pylori-LPS调控miR-106表达的机制研究H. pylori-LPS刺激胃癌AGS和MKN45细胞12小时，MCM7的蛋白和mRNA水平无表达差异。高表达的MDM2可以下调胃癌AGS和MKN45细胞中miR-106b表达。3.2JAK1和STAT3是miR-106b下游靶基因的验证胃癌细胞转染miR-106b mimics和pGL-JAK1-wt，可以下调JAK1的3’UTR荧光素酶活性(P <0.01)，但转染miR-106b mimics和pGL-JAK1-mut，JAK1的3’UTR荧光素酶活性无明显改变；同样，转染miR-106b mimics和pGL-STAT3-wt，可以下调STAT3的3’UTR荧光素酶活性(P <0.01)，而转染miR-106b mimics和pGL-STAT3-mut，STAT3的3’UTR荧光素酶活性无明显改变。此外，高表达的miR-106b可以引起JAK1和STAT3的蛋白和mRNA表达水平降低。3.3H. pylori-LPS对JAK1、JAK2和STAT3的调控H. pylori-LPS作用胃癌AGS细胞不同时间点（0、1、10、30、60分钟），可以增强JAK1、JAK2和STAT3的磷酸化水平。H. pylori-LPS作用胃癌AGS和MKN45细胞12小时后，可以引起JAK2蛋白表达水平增加。结论：1. H. pylori可以通过其毒力因子LPS下调miR-375和miR-106b在胃癌细胞的表达；H. pylori-LPS对miR-375和miR-106b的抑制作用可能通过Dicer介导。2. H. pylori-LPS可以通过下调miR-375引起其靶基因Sp1表达增高，促进对MDM2的转录调控，高表达MDM2可以通过降低p63表达而抑制Dicer表达，进一步下调miR-375的表达，最终形成Sp1/MDM2/Dicer一个正反馈途径。3. JAK1和STAT3是miR-106b在胃癌细胞的直接调控基因。而JAK2也已被证实是miR-375的靶基因，因此H. pylori-LPS一方面可以抑制miR-375和miR-106b表达上调JAK1、JAK2和STAT3，另一方面可以增强JAK1、JAK2和STAT3的磷酸化水平，提示H. Pylori的毒力因子LPS和JAK/STAT3的信号通路关系密切。4. MDM2在H. pylori-LPS诱导miRNA表达过程中起着重要的作用。