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乳腺纤维化是一种严重的病理过程,该病理过程会严重缩短奶牛泌乳年限,降低产奶量和乳品质,造成巨大的经济损失。越来越多的证据表明线粒体损伤在纤维化病变的发生发展中起到重要促进作用。乳腺上皮细胞线粒体损伤释放的有害物质,如活性氧（ROS）的大量积累不但导致乳腺上皮细胞的损伤,甚至引起乳腺纤维化表型指标的升高,并最终形成纤维化病变。因此减轻ROS积累、缓解线粒体损伤、抑制纤维化表型指标的升高可能是阻止乳腺纤维化病变的潜在治疗措施。G蛋白偶联受体109A（GPR109A）是细胞膜表面的受体,其具有较强的降血脂、抗炎和抗肿瘤等功能。有研究表明GPR109A对慢性肾病过程中的纤维化病变具有缓解作用,但其具体机制尚不明确。所以本研究推测,GPR109A可能是乳腺纤维化的潜在治疗靶点。因此本实验采集了临床型2级奶牛乳腺炎的乳腺组织,建立了TGF-β1诱导的奶牛乳腺上皮细胞（b MECs）模型、TGF-β1诱导的小鼠乳腺纤维化模型和TGF-β1诱导的小鼠乳腺上皮细胞（m MECs）模型,系统研究了GPR109A对乳腺纤维化的影响及其潜在机制。在临床型2级奶牛乳腺炎的乳腺组织中发现,TGF-β1、Collagen1、α-SMA、Vimentin的基因和蛋白水平显著高于对照组,E-cadherin基因和蛋白水平显著低于对照组。这些结果说明奶牛乳腺炎组织存在纤维化病变。此外,乳腺组织线粒体MFN2、TFAM、VDAC1和HSP60的蛋白水平显著低于对照组,Cyto C的蛋白水平显著高于对照组,线粒体呼吸链氧化磷酸化复合物COI、COⅡ和COⅣ的m RNA水平显著低于对照组。这些结果说明纤维化的奶牛乳腺组织中线粒体受损。在TGF-β1诱导的b MECs模型中发现,除上述线粒体损伤指标显著升高外还有大量ROS积累并且纤维化指标也显著升高,说明ROS可能是TGF-β1诱发线粒体损伤和乳腺纤维化的关键刺激因素。另一方面,在纤维化的奶牛乳腺组织和TGF-β1诱导的b MECs模型中发现,GPR109A的基因和蛋白水平均显著上调,这一结果说明GPR109A与乳腺纤维化呈正相关性。在TGF-β1诱导的m MECs模型中发现,沉默GPR109A显著促进α-SMA、Collagen 1和Vimentin的蛋白水平显著升高。激活GPR109A可以显著缓解以上纤维化表型指标的升高。这些结果说明,沉默GPR109A促进了m MECs纤维化表型指标的升高,而激活GPR109A显著缓解m MECs纤维化表型指标的升高,GPR109A可能是缓解乳腺纤维化的潜在治疗靶点。在TGF-β1诱导的小鼠乳腺纤维化模型中发现,敲除GPR109A促进α-SMA、Collagen 1和Vimentin的蛋白水平显著升高。乳腺组织过表达GPR109A可以显著地缓解以上纤维化表型指标的升高。这些结果进一步证实GPR109A对乳腺纤维化具有缓解作用,GPR109A可能是缓解乳腺纤维化的潜在治疗靶点,但具体机制尚不明确。为进一步探究GPR109A缓解乳腺纤维化的下游调控信号,本实验对小鼠乳腺进行了RNA-seq测序。研究结果发现,与WT-TGF-β1组相比,GPR109A-TGF-β1组有624个基因上调和224个基因下调;对差异表达的基因进行KEGG分析,选取富集分析结果中最显著富集的前20基因绘制散点图。通过系统分析,本研究发现PPARγ可能是缓解纤维化的重要信号。在TGF-β1诱导的m MECs模型中,抑制PPARγ阻断了GPR109A对线粒体损伤的缓解作用以及对乳腺纤维化的缓解作用。另一方面激动PPARγ则显著缓解因沉默GPR109A而造成的m MECs线粒体损伤和乳腺纤维化表型指标的升高。这一结果说明GPR109A通过下游信号PPARγ发挥对乳腺纤维化的缓解作用。此外研究发现在TGF-β1诱导的m MECs模型中,应用ROS清除试剂（NAC）有效地缓解了线粒体膜电位的降低和MFN2蛋白水平的降低,有效地抑制了Collagen 1蛋白水平的升高。这一结果说明清除ROS能够有效缓解细胞线粒体损伤和抑制纤维化表型指标的升高。在TGF-β1诱导的小鼠乳腺纤维化模型中发现,清除ROS有效缓解因GPR109A基因缺失而造成的线粒体损伤和乳腺纤维化表型指标的升高。在TGF-β1诱导的m MECs模型中发现,清除ROS有效缓解因沉默GPR109A或沉默PPARγ基因而造成的线粒体膜电位降低、MFN2蛋白水平降低以及Collagen 1蛋白水平的升高。这些结果共同说明GPR109A/PPARγ信号通过清除细胞中的ROS,减轻线粒体损伤,进而缓解乳腺纤维化。最后本研究在TGF-β1诱导的b MECs模型中验证GPR109A对线粒体损伤和乳腺纤维化的缓解作用,研究结果表明激活GPR109A有效地缓解了TGF-β1诱导的b MECs线粒体损伤和纤维化表型指标的升高。这一结果证实了GPR109A在b MECs上对乳腺纤维化缓解的有效性。综上所述,本研究发现GPR109A显著缓解乳腺纤维化表型指标的升高。机制研究发现,GPR109A/PPARγ信号通过减轻ROS的积累,缓解线粒体损伤进而减轻乳腺纤维化倾向,提示GPR109A具有成为抗乳腺纤维化靶点的潜力。