丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是唇形科鼠尾草属植物,其药用部位根和根茎中含有多种活性成分,被广泛应用于心血管类疾病的治疗。丹参具有外源基因转化体系成熟、基因组小等优势,被认为是一种“模式药用植物”。随着全球气候变暖、土壤盐渍化等环境问题加重,人工种植丹参的产量越来越受到各种逆境胁迫的制约。普遍胁迫蛋白(USP)是一种能广泛响应多种胁迫,提高微生物和植物抗逆能力的蛋白,目前在丹参中对该类蛋白的研究非常有限。本实验基于丹参基因组数据库,利用拟南芥中的UspA保守结构域序列在丹参的数据库中检索并确认了 32个含有UspA结构域的丹参普遍胁迫蛋白基因(SmUSP)家族成员,利用生物信息学方法研究了 32个成员的基本性质以及它们的进化关系。然后,通过qRT-PCR技术研究了 32个成员在丹参的根、茎、叶、花和种子中的表达模式,以及它们对盐、热、盐和热的共同胁迫的响应情况。最后,从克隆得到的9个成员中选择了 3个构建到原核表达载体中,检测过表达SmUSP基因的大肠杆菌对盐、热以及它们的共同胁迫的抵御能力。本研究为深入研究SmUSP基因的功能,培育抗逆能力强的丹参新品种提供了一定参考。本实验的主要研究结果如下:(1)经过对UspA结构域的验证,确认了检索得到的32个基因均为SmUSP基因家族成员,其cDNA长度从279 bp到2247 bp不等,gDNA的长度范围是362 bp到5478 bp。生物信息学预测结果显示:蛋白分子量则是从10.36k Da到83.95k Da,等电点最小是4.87,最大是11.16,主要在细胞质基质中发挥作用。32个SmUSP基因家族成员与拟南芥USP蛋白聚成的进化树一共分为A、B、C、D四个组,A、B两组中的成员都含有ATP结合序列G-2X-G-9X-G(S/T),属于ATP结合组,其他成员属于非ATP结合组。ATP结合组中的成员都拥有与ATP结合有关的二级结构。32个SmUSP基因家族成员的外显子-内含子分布结构十分相似,0号相位的内含子较少。通过克隆得到了 9个表达量较高的SmUSP基因家族成员,他们的基因序列与数据库中的基本一致。(2)32个SmUSP基因家族成员中有29个在根、茎、叶、花以及种子五个部位中都有表达,其余3个成员表现出明显的组织特异性,其中SmUSP31在种子中不表达,SmUSP18在根中不表达,而SmUSP20只在茎和种子中表达。有16个成员在种子中的表达量最高,有10个在根中的最高,3个在叶中最高,2个在花中最高,而SmUSP9在茎中有最高的表达量。启动子分析结果表明,32个SmUSP基因家族成员的启动子区含有ABRE、HSE、MBS等与胁迫响应有关的顺式作用元件。14个SmUSPs基因家族成员受到盐胁迫后发生了显著上调,而8个成员发生了显著的下调。热胁迫条件下,13个成员的表达量显著升高,11个成员的表达量显著降低。盐和热共同处理植物后,仅SmUSP24和SmUSP28的表达显著上调,大多数成员(24个)的表达显著下调。(3)将SmUSP1,SmUSP8和SmUSP27分别构建到原核表达载体pET-28a中,Western Blot检测外源蛋白在大肠杆菌BL21中的表达情况。过表达SmUSP基因的大肠杆菌在胁迫条件下的生长情况优于对照,其中ATP结合组成员SmUSP1和SmUSP27对盐胁迫的抵御能力最好,非ATP结合组成员SmUSP8对热胁迫的抵御能力最强。而在盐和热共同胁迫条件下,抵御逆境的能力从强到弱依次是:SmUSP27>SmUSP8>SmUSP1。