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第一部分抑瘤素M在钙化主动脉瓣膜中的表达目的:探究钙化性主动脉瓣膜病（CAVD）中OSM表达及来源。方法:（1）利用生物信息学数据库（GSE153555）分析正常和钙化瓣膜中OSM表达;（2）经华中科技大学同济医学院医学伦理委员会批准,收集CAVD患者、主动脉夹层患者及心脏移植受体主动脉瓣,茜素红染色检测钙结节沉积,PCR、WB和免疫组化检测OSM、Runx2、ALP表达,免疫荧光双染检测CD3+T细胞、CD68+巨噬细胞和OSM表达;（3）采用10X genomics单细胞测序平台,对健康和钙化瓣膜组织进行高通量单细胞测序,鉴定细胞亚群。分析OSM及OSM受体OSMR、LIFR在瓣膜间质细胞、T细胞、巨噬细胞、DC细胞中的表达。（4）高脂/高胆固醇饮食喂养Apo E KO小鼠和WT小鼠,构建CAVD动物模型,检测瓣膜中OSM表达。结果:（1）生物信息学分析表示:CAVD瓣膜中OSM表达水平升高;（2）茜素红染色示CAVD瓣膜中大量钙结节沉积,q PCR、免疫组化和WB检测见钙化瓣膜中OSM、Runx2、ALP表达上调;（3）单细胞测序分析从6个瓣膜样本中总共解离分析了31,043细胞。定义7个瓣膜间质细胞（VICs）亚群及T细胞群、巨噬细胞群、DC细胞群。在钙化瓣膜中OSM存在于瓣膜间质细胞、T细胞及巨噬细胞、DC细胞,在巨噬细胞表达明显增高;OSMR、LIFR表达于瓣膜间质细胞、T细胞、巨噬细胞及DC细胞,在瓣膜间质细胞表达明显增高。免疫荧光双染示存在OSM+CD3+T细胞和OSM+CD68+巨噬细胞;（4）高脂/高胆固醇饮食喂养ApoE KO小鼠24周,超声检测提示其跨瓣峰值流速显著上升,Von Kossa染色提示钙结节形成增加,免疫荧光提示瓣膜中OSM表达显著上调且主要来源于CD68+巨噬细胞。结论:人及小鼠钙化主动脉瓣膜中高表达OSM,且主要来源于CD68+巨噬细胞,OSM受体OSMR、LIFR在钙化瓣膜主要表达于瓣膜间质细胞。第二部分抑瘤素M/抑瘤素M受体轴激活促进瓣膜间质细胞成骨样分化目的:瓣膜间质细胞成骨样分化是钙化性主动脉瓣膜病发生发展的关键环节,本部分探索OSM/OSM受体轴激活对瓣膜间质细胞（VICs）成骨样分化的影响。方法:收集心脏移植患者和主动脉夹层患者主动脉瓣膜提取瓣膜间质细胞,（1）采用免疫荧光检测Vimentin和CD31表达;（2）免疫荧光检测OSMR和LIFR表达;（3）不同浓度OSM（ng/ml）（0、1、5、10）干预VICs 48h,WB测定成骨蛋白Runx2、ALP表达,相同浓度OSM干预VICs,不同时间（0、12、24、48、72h）后WB测定成骨蛋白Runx2、ALP表达;OSM（5ng/ml）干预VICs 24h,q PCR测定Runx2、ALP m RNA表达;OSM干预VICs,在钙化培养基培养14天后行茜素红染色;（4）OSM干预VICs 24h,q PCR检测OSMR、LIFR m RNA表达;（5）比较OSM、IL6、TNF-α、TGF-β、OM不同刺激因子对瓣膜间质细胞成骨样分化作用;（5）si RNA沉默VICs中OSMR、LIFR后,加入OSM,测定Runx2、ALP表达及钙结节形成;（6）采用RNA-seq对OSM处理的VICs进行转录组测序分析。结果:（1）VICs表达间质细胞标志Vimentin且不表达内皮细胞标志CD31;（2）VICs表达OSMR和LIFR;（3）5ng/ml OSM干预48h,VICs中Runx2、ALP表达显著上调,并在钙化培养基培养14天后形成钙结节;（4）与IL-6、TNF-α、TGF-β、钙化培养基相比,OSM对瓣膜间质细胞成骨样分化作用更强;（5）OSM干预VICs,OSMR、LIFR表达增加,si RNA沉默OSMR、LIFR后,Runx2、ALP表达降低,钙结节形成减少;（6）测序分析提示对照组与OSM组共有差异基因（DEG）985个,其中498个DEG上调,487个DEG下调。KEGG信号通路富集分析差异基因高度富集在蛋白消化与吸收、因子-因子受体相互作用、JAK-STAT信号等通路途径,且OSMR、LIFR、JAK2、JAK3、STAT3基因表达明显上调。结论:OSM通过结合受体OSMR和LIFR,引起VICs中Runx2、ALP表达增加,促进成骨样分化。转录组测序分析显示OSM可能通过激活JAK-STAT通路促进VICs成骨样分化。第三部分抑瘤素M激活JAK-STAT信号通路促进瓣膜间质细胞成骨样分化目的:探讨OSM促进瓣膜间质细胞（VICs）成骨样分化的机制,为相关药物及靶向治疗提供理论基础。方法:（1）OSM干预VICs,在不同时间点（0、1、2、5、10、15、30、60min）,WB测定JAK2、JAK3、STAT1、STAT3、p38、JNK、ERK、P65磷酸化水平;（2）JAK2抑制剂（AG-490）和JAK3抑制剂（WHI-P54）预处理VICs,OSM干预,测定Runx2、ALP表达及钙结节形成;（3）si RNA沉默STAT3,加入OSM,测定Runx2、ALP表达及钙结节形成;（4）免疫荧光双染检测OSM干预下p-STAT3入核情况;（5）OSM干预VICs,加入MCL,检测Runx2、ALP表达及钙结节形成;（6）OSM干预VICs,加入MCL,检测STAT3磷酸化水平;（7）MCL+高脂/高胆固醇饮食喂养Apo E KO小鼠24周,检测其跨瓣峰值流速及钙结节形成,免疫荧光染色检测STAT3磷酸化水平。结果:（1）OSM引起VICs中JAK2、JAK3、STAT3磷酸化水平随着时间增加上调,而STAT1、p38、JNK、ERK、P65磷酸化水平无明显改变;（2）OSM干预VICs,加入JAK2、JAK3抑制剂后,STAT3磷酸化水平下调,Runx2、ALP表达降低,钙结节形成减少;（3）OSM干预VICs后,si RNA沉默STAT3后,Runx2、ALP表达降低,钙结节形成减少;（4）OSM干预VICs后,免疫荧光显示p-STAT3入核增加;（5）OSM干预VICs后,MCL降低Runx2、ALP表达和钙结节形成;（6）MCL干预VICs后,抑制OSM介导VICs中STAT3磷酸化;（7）相比Apo E KO组,MCL+Apo E KO组跨瓣峰值流速显著下降,Von Kossa染色示钙结节明显减少;（8）相比Apo E KO组,MCL+Apo E KO组主动脉瓣STAT3磷酸化水平下调;结论:OSM通过结合VICs受体OSMR和LIFR,激活p-JAK2和p-JAK3,促进转录因子STAT3磷酸化及入核,诱导Runx2和ALP表达增加,促进成骨样分化。MCL抑制OSM介导VICs中p-STAT3表达,减轻VICs成骨样分化。同时,MCL减轻高脂/高胆固醇喂养的Apo E KO小鼠主动脉瓣p-STAT3表达和主动脉瓣钙化。