睾丸注射白消安制备小鼠精原干细胞移植受体及精原干细胞移植

来源 :吉林农业大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:focus2316acn
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精原干细胞移植对于研究精子发生和制作转基因动物以及男性避孕等方面有重要的理论和实际意义。目前,已建立了一些精原干细胞移植受体制备方法,例如腹腔注射白消安、热应激以及辐射法。但是这些方法均存在不同缺陷,如白消安药物对靶器官以外组织器官的严重毒副作用、热激法受体的移植操作窗口期较窄和辐射法需要专门的仪器设备等。为获得理想的受体制备效果,本研究对雄性ICR小鼠的双侧睾丸注射白消安,采用4,6mg/kg/side两个剂量组,以腹腔注射40mg/kg白消安组作为阳性对照,睾丸注射50%的DMSO组做为阴性对照。分别在注射后第14、21、28、35和70天检测受体小鼠的死亡情况,采集血液样品进行血常规分析,测量体重、睾丸重,同时,采集各组各个时间点的睾丸制作切片,染色后分析组织切片中曲细精管空腔的变化和各级生殖细胞的变化情况。实验结果表明,睾丸注射白消安后,受体鼠血液中RBC、WBC、PLT和HGB成分变化较小,整体呈现先下降后逐渐回升的变化趋势,但与阴性对照组间的偏差较小,只是个别时间点呈现显著差异,而且受体小鼠未发生致死现象,说明睾丸注射白消安的毒害作用很小。相反,作为阳性对照的腹腔注射组,受体小鼠血液中的RBC、WBC、PLT和HGB成分发生了显著变化,虽然随着时间的推移,在第70天时也恢复到了对照组水平,但各项指标在整个实验过程中变化较大,持续时间较长,有更多的检测点与阴性对照间存在显著差异,并且检测到了高达31.6%的受体鼠死亡现象。组织切片检测结果表明,睾丸注射白消安组与腹腔注射白消安组相比,曲细精管空管较快,达到最大空管期后持续时间较长,且这些变化随着白消安剂量的增加更加显著。通过比较睾丸注射两个剂量组的组织切片变化情况,选择6mg/kg/side剂量组小鼠在睾丸注射白消安后16-17天作为精原干细胞移植受体,将4-7日龄转基因C57BL/6J供体小鼠睾丸组织制备细胞悬液,经过短暂的贴壁差异分选后将精原干细胞悬浮液通过睾丸输出管移植到受体小鼠睾丸中,移植后42天进行小动物活体荧光成像观察,将睾丸部位有荧光的受体鼠与ICR母鼠按1:2进行合笼,最终得到了供体后代。结果表明,通过睾丸注射白消安有效消除了内源性生殖细胞,通过SSCs移植使受体鼠生育力得到了恢复,并且通过荧光检测、PCR检测和毛色辨认,证明获得了供体后代小鼠,本研究成功建立了睾丸注射白消安受体制备技术,并在啮齿类动物应用中证明是安全可靠的。
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