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耳聋是世界性公共卫生问题。耳蜗毛细胞和听神经损伤或功能异常引起的感音神经性聋（sensorineural hearing loss,SNHL）是造成不可逆性听力损失的主要疾病。助听器和人工耳蜗植入技术虽然可以在一定程度上补偿听力,但是,对于SNHL疾病本身,仍然缺乏理想的对因治疗方法。诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSC）技术可将多种体细胞进行重编程,使其具有与胚胎干细胞相似的分化潜能。iPSC在一定条件下体外可定向分化为听祖细胞、毛细胞样细胞及螺旋神经节神经元（spiral ganglion neurons,SGN）样细胞,可移植回体内,取代原有损伤或功能异常细胞。这项技术为SNHL的治疗提供了新思路。基因缺陷是先天性重度和极重度SNHL主要致病因素。利用基因编辑技术可对有明确基因缺陷的SNHL患者来源iPSC进行基因矫正。因此,诱导性多能干细胞技术和基因编辑技术的结合似乎使这类SNHL的生物治疗成为可能。听神经病谱系障碍（auditory neuropathy spectrum disorder,ANSD 或称为听神经病）是一类听力学表现为耳声发射和/或耳蜗微音电位正常,但听性脑干反应引不出或明显异常的特殊类型SNHL。OTOF基因突变是先天性ANSD的常见病因。利用基因编辑技术对ANSD患者来源iPSC中突变的OTOF基因进行矫正,可成为ANSD干细胞移植治疗和基因治疗研究的重要途径。此外,OTOF基因突变ANSD患者来源iPSC本身也可作为细胞模型,在体外模拟ANSD发病过程,用于OTOF基因突变致病机制的研究。因此,本文将报告1例OTOF基因突变ANSD病例,将该病例患者来源的成纤维细胞重编程为iPSC,并尝试利用CRISPR/Cas9技术对iPSC中OTOF基因突变进行矫正。论文分为以下三个部分。第一部分,报告1例ANSD病例。经分子诊断明确,该例ANSD是由于OTOF基因复合杂合突变（c.2122C>T/c.519 7G>A,NM194248）所致。该病例接受了Nucleus CI24 Contour Advance人工耳蜗植入手术。术中及术后开机时神经电反应遥测（neural response telemetry,NRT）结果显示,所有22个耳蜗内电极导联均可引出明确的电刺激诱发复合动作电位（electrically.evoked compound action potential,ECAP）波形。与7例年龄和听力损失严重程度相近的典型SNHL病例的NRT结果比较,发现该ANSD病例术中ECAP阈值（t-NRT值）与典型SNHL病例接近,但术后开机时t-NRT值相对较低。提示OTOF基因突变ANSD病例听神经功能完成,术后开机时可能听神经敏感性更高。第二部分,构建OTOF基因突变ANSD病例患者来源iPSC。通过将五个关键转录因子:OCT3/4,SOX2,KLF4、L-MYC和LIN28,导入患者来源成纤维细胞,诱导其重编程,最终得到碱性磷酸酶染色阳性、表达多能干细胞特异性标志基因和蛋白、具有体外三胚层分化潜能、符合国际公认标准的iPSC。经Sanger测序验证,获得的iPSC基因型为OTOF基因复合杂合突变（c.2122C>T/c.5197G>A）。采用单层贴壁法在体外将iPSC向SGN样细胞诱导分化,获得的细胞表达SGN特异性标志基因和蛋白,提示获得的iPSC具有定向诱导分化为内耳细胞的潜能,是体外模拟ANSD发病过程及研究OTOF基因突变致病机制的理想细胞模型。第三部分,利用CRISPR/Cas9介导同源重组修复对iPSC中OTOF基因突变进行矫正。通过CRISPR/Cas9打靶载体与单链寡核苷酸（single-stranded donor oligonucleotide,ssODN）同源重组模板共转染、药物筛选、挑单克隆、Sanger测序与酶切验证,最终得到2株OTOF基因c.2122C>T位点被纯合矫正的iPSC。对8个有较高脱靶概率的位点进行检测,未发现脱靶。CRISPR/Cas9技术对患者来源iPSC中OTOF基因特定突变位点进行精确修复具有可行性,可成为ANSD基因治疗的新途径。总之,OTOF基因突变ANSD病例的听神经功能完整,是人工耳蜗植入手术治疗的理想适应症。OTOF基因突变ANSD患者来源iPSC可体外定向分化内耳细胞,用于模拟ANSD发病过程及OTOF基因突变致病机制的研究。利用CRISPR/Cas9技术可实现对iPSC中OTOF基因突变的精确修复,使得这类ANSD病因治疗成为可能。