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β-防御素(β-defensin)是一类重要的天然免疫分子。本课题组首次于2001年报道了大鼠附睾特异性表达的β-防御素-Binlb,并发现Binlb除了具有抗菌活力外,还能够起始精子运动,提示附睾中的β-防御素可能对精子在附睾成熟过程中产生影响。已发现在食蟹猴中,高度糖基化的β-defensin 126 (DEFB126)从附睾体部分泌并覆盖在整个精子表面,是精子糖萼(Glycocalyx)的主要糖蛋白成分,在精子穿过宫颈黏液,逃避女性生殖道的免疫监视以及免疫反应,介导精子与输卵管上皮细胞的结合等方面起重要的作用。最近有报道,约有20%的男性,其DEFB126基因编码区发生两个核苷酸缺失的移码突变,并且发生纯合突变(del/del)的男性其自然生育力显著降低。分子机制研究发现,del/del男性附睾中产生的DEFB126 mRNA表达降低,精子与特异性识别O-linked寡糖的双孢子蘑菇凝集素(Agaricus bisporus, ABA)结合能力以及精子穿过透明质酸(宫颈黏液的替代溶液)能力也显著降低,因此研究者推测发生DEFB126纯合移码突变的精子其表面糖结构发生了变化,但目前这一推测的证据尚不充分。目前,用于研究细胞表面糖结构图谱的新型有效工具是凝集素芯片(Lectin microarray)技术,用此技术在人精子细胞中研究糖结构图谱的变化,则属空白。本课题利用凝集素芯片试图阐明发生DEFB126移码突变(del/del)的精子,其细胞表面与凝集素结合谱的变化情况,同时发现可用于识别精子糖结构变化的潜在生物标记物。我们利用上海交通大学陶生策教授课题组自制的含91种凝集素的芯片,对人精子细胞的保存和染色条件进行了优化,最终选取经2%多聚甲醛/0.2%戊二醛固定的精子,碘化丙啶(Propidium iodide, PI)染色标记的方法,首次获得了人精子表面凝集素结合图谱；并通过凝集素芯片,比较了DEFB126基因移码突变对精子表面凝集素结合图谱的影响,发现有6种凝集素与del/del基因型男性精子的结合显著降低；经荧光显微镜和流式细胞仪验证,进一步确定了橙桑凝集素(Maclura pomifera lectin, MPL)与ABA一样,与del/del基因型的精子结合能力降低,同时也用单盲实验证明了MPL可以作为精子受精能力降低的潜在生物标记物。该结果将对不明原因男性不育的临床诊断及治疗具有重大意义。另外,我们还对大鼠附睾特异表达的β-defensin 42 (Defb42)进行了重组表达及功能研究。特异表达在附睾起始区的Defb42只与此处的精子结合,并结合在精子顶体以及顶端质膜处。为了研究Defb42的基因功能,我们筛选了能下调Defb42表达的有效siRNA片段,并包装了含该有效siRNA片段的高滴度病毒,利用RNAi技术开展了Defb42的功能研究。但附睾起始区易发生炎症反应,我们发现炎症反应会导致Defb42的蛋白表达量显著下降,且Defb42的表达与炎症因子IL-1β,IL-6之间呈负相关关系。我们用pCMV-Tag4真核表达系统,并转染293T细胞,成功表达了Defb42蛋白,其细胞上清液能够抑制大肠抗菌(E. coli K12D31)以及金黄色葡萄球菌(S. aureu CMCC26003),但对抗白色念珠菌(C. albicans SC5314)则没有影响。第三部分我们利用pTWIN1原核表达系统对功能未知的人β-defensin6 (DEFB106)进行了重组表达研究,经过融合标签切割条件的优化以及分子排阻层析纯化后,最终可以获得3-5 mg/L重组DEFB106,其纯度可达95%。重组获得的DEFB106的分子量与理论分子量相似,并具有较高程度的β-折叠二级结构,与典型的P-defensin结构相符；对E. coli、S. aureu和C. albicans都有抑制作用,并且与肝素和脂多糖都有结合作用,表明DEFB106可能在天然免疫以及获得性免疫中起重要作用。天然的DEFB106主要分布在骨髓,皮肤以及附睾组织中。在附睾中则主要分布在附睾体尾部基底细胞的细胞核中。上述综合研究对DEFB106的功能探索具有一定的指导作用。