肝部分切除术(Partial hepatectomy, PH)是目前治疗各种肝脏良恶性疾病最有效方法,但PH范围过大或肝脏本身处于一种严重的病理条件时易导致肝功能衰竭,这是一个临床上非常棘手的问题。尽管肝移植术能够有效解决该问题,但现行医疗体制下供体匮乏、价格昂贵等问题使得肝移植术难以广泛开展；而现有生物人工肝技术尚不成熟,体内肝细胞移植术治疗效果有限。故如何解决该问题引起了世界范围内的思考。肝脏再生能力极强,PH术后肝细胞能够迅速的复制增殖实现再生,然而目前对其自身调控机制尚不清楚。如果了解其机制,能够帮助我们人工创造良好的肝再生环境,无论PH范围的大小或是肝脏处于何等严重的病理条件。因此,探索肝再生自身调控机制具有极其重要的临床意义。本课题组前期研究显示,Tmub1 (transmembrane and ubiquitin - like domain containing 1)蛋白在肝细胞增殖进程中发挥了重要的负向调控作用。2005年,Fazia等学者首次报道Tmub1蛋白,它在肝细胞增殖过程中发挥重要作用。目前,已知Tmub1蛋白在肝再生过程和神经系统中表达相对较高,然而其所扮演的角色尚不十分清楚。在肝再生过程中,Tmub1表达增高,在该程中发挥负向调节作用,可以有效防止肝细胞过度增殖；在神经系统中,Tmub1蛋白高表达于大脑内,利于细胞表面回收利用AMPAR(α-氨基羟甲基恶唑丙酸受体)亚基GluR2,并且Tmub1蛋白能够与钙离子信号调节亲环素配体(Calcium modulating cyclophilin ligand, CAML)相互作用,参与自发活动和觉醒的调控。研究结果表明Tmub1基因及其蛋白在肝再生进程中扮演着重要的调控角色,然而其机制仍不清楚。研究目的：1、利用慢病毒干扰技术下调Tmub1的表达,观察其对正常大鼠PH术后肝细胞增殖周期及肝再生的影响；2、分析可能相关的调控蛋白,初步探讨Tmub1蛋白对肝细胞增殖的调控机制；3、了解肝硬化条件下Tmub1蛋白在肝脏中的表达是否异常,并探讨其意义；4、利用慢病毒干扰技术,分析肝硬化条件下Tmub1蛋白的异常变化对肝功及肝细胞增殖的影响,并探讨其机制。研究内容及方法：1.Tmub1基因沉默对正常大鼠肝部分切除术后肝细胞增殖的影响1.1实验条件及分组。实验条件：雄性Sprague-Dawly大鼠(质量200-300g)置于标准条件下：12h白昼交替,保持室温恒定,使大鼠能自由接触水和食物,保证各组间大鼠的体重及生活习惯无明显差别。将54只大鼠随机进行分组,其中Tmub1 RNAi实验组、空载慢病毒组分别通过肠系膜上静脉注射相应病毒颗粒(慢病毒每O.1ml为一个注射单位,约3×107TU病毒量,每次注射前用PBS稀释至10倍),对照组未行注射操作,2天后行PH术。每组分为6个亚组：PH术后Oh、2h、6h、12h、24h、48h,且每亚组含有3只大鼠。术后留取肝脏组织标本、利用原位组织消化法提取的原代肝细胞。1.2建立大鼠PH术动物模型。1.3原位肝细胞分离与原代肝细胞培养。按实验分组于PH术后Oh、2h、6h、2h、 24h、48h分别留取大鼠10g左右肝脏组织,原位消化肝脏,提取原代肝细胞,台盼蓝染色测定细胞总数及细胞活力,并将肝细胞培养于培养瓶中,以便后期MTT实验及流式细胞术分析细胞增殖周期。1.4RT-PCR法检测mub1 mRNA、securin mRNA水平。1.5 Western Blot法检测Tmub1蛋白、securin蛋白表达情况。1.6 噻唑蓝(MTT)试验检测各组肝细胞增殖情况。1.7用流式细胞仪观察各组细胞周期2. Tmub1基因沉默对肝硬化大鼠肝部分切除术后肝细胞增殖的影响2.1实验条件及分组。实验条件：雄性Sprague-Dawly大鼠(质量200-300g)置于标准条件下：12 h昼夜交替,保持室温恒定,使大鼠能自由接触水和食物,确保各组大鼠生活环境无明显差异。将9只雄性SD肝硬化大鼠随机分组,另有3只正常雄性SD大鼠作为标准对照组,其中Tmubl RNAi实验组、慢病毒空载组通过肠系膜上静脉分别注射相应病毒(慢病毒每0.1ml为一个注射单位,约3×107TU病毒量,每次注射前用PBS稀释至10倍),对照组无注射操作,注射慢病毒2天后行PH术。PH术后24h,留取肝脏组织及血清标本。2.2 SD大鼠肝硬化动物模型的建立。取雄性SD大鼠20只,体重180-200g。于SD大鼠颈、背部皮下注射99.9%的CC14(首剂0.5mL/100g体重),以后每周两次皮下注射40% CC14油剂(将99.9%分析纯CC14与花生油按4：6比例混合),剂量为0.3 mL/100g体重,并允其自由饮用自来水、进食高脂饲料,共6周。实验动物成模的标准：随机取3只大鼠剖腹取适量肝组织做活检以确定是否形成肝硬化,即肉眼直视下有硬化结节形成,组织切片HE染色见肝小叶结节紊乱和假小叶形成。2.3 SD大鼠PH术动物模型的建立。2.4肝功能检测以了解肝硬化程度、肝功能状态。2.5 Ki67免疫组化实验检测肝细胞增殖状态。2.6 Western blot实验技术检测不同条件下Tmub1蛋白水平。2.7 Q-PCR实验技术检测不同实验条件下Tmub1 mRNA、IGF1 mRNA、HGF mRNA、TGF-β1 mRNA、C/EBP-βmRNA、STAT3 mRNA、WT-1 mRNA水平差异。结果：1. Tmub1基因沉默对正常大鼠肝部分切除术后肝细胞增殖的影响1.1 Tmubl RNAi的干扰效果检测。实验组Tmub1 mRNA和蛋白表达均显著降低p<0.05)。1.2 Tmub1沉默对肝细胞增殖的影响。MTT实验结果显示,于PH术后6h、12h、24h提取的肝细胞经过相同培养时间后,Tmub1 RNAi实验组细胞明显较另两组细胞量多,间接反映增殖速率快。上述结果证明,Tmub1的下调可明显上调PH术后6h-24h肝细胞的增殖速率。流式细胞分析结果表明实验组处于G2/M期的肝细胞比例明显高于对照组,差异具有统计学意义(p<0.05)。1.3 Tmub1沉默后对securin mRNA及其蛋白表达的影响。在Tmub1沉默后,securinmRNA表达无明显变化,而G2/M期securin蛋白量明显降低。这说明Tmub1的沉默未影响securin蛋白的基因转录(即未影响securin蛋白的合成),而是加速了securin蛋白的降解。2. Tmub1基因沉默对肝硬化大鼠肝部分切除术后肝细胞增殖的影响2.1肝硬化大鼠病理学观察。显微镜下,正常肝小叶结构破坏,纤维结缔组织异常增生,广泛假小叶形成。2.2 Tmub1 RNAi干扰效果检测。实验组Tmub1 mRNA和蛋白表达均显著降低p<0.05)。2.3 Western blot及Q-PCR实验技术检测正常大鼠与肝硬化大鼠Tmub1蛋白表达情况。肝硬化大鼠Tmub1基因水平及蛋白水平较正常大鼠均显著增高。2.4不同实验模型下肝功能差异检测。Tmub1 RNAi组大鼠的肝功能较肝硬化组及慢病毒空载组大鼠的肝功能显著好转且具有统计学差异,n=3,p<0.05。2.5 Ki-67免疫组化方法检测不同实验模型下肝细胞增殖状态情况。通过Tmub1RNAi干扰技术下调Tmub1的表达后,其Ki-67阳性率有明显上调(与肝硬化组及慢病毒空载组比较),表明肝硬化条件下,Tmub1的下调能够有效促进PH术后的肝细胞再生。2.6 Q-PCR实验技术检测不同实验模型下IGF1 mRNA、HGF mRNA、TGF-β mRNA、C/EBP-βmRNA、STAT3 mRNA、WT-1 mRNA水平差异。本肝硬化模型下IGF1 mRNA, HGF mRNA, TGF-β1 mRNA, C/EBP-βmRNA, WT-1 mRNA显著增多,STAT3 mRNA则明显下调,各因子的变化均有统计学意义,b：与正常组比较,n=3,p<0.05；通过Tmub1 RNAi技术下调Tmub1表达后,IGF1 mRNA, HGF mRNA, TGF-β1 mRNA, C/EBP-βmRNA, WT-1 mRNA均有明显下降(趋近于正常组水平),STAT3则有显著上调(趋近于正常组水平),各因子的变化均有统计学意义。结论：1慢病毒载体适用于目的基因的RNA干扰实验,并且在体内实验中亦能发挥较好的效果。2 Tmub1蛋白可能在肝细胞增殖周期G2/M期发挥重要作用。3 Tmub1蛋白在肝再生过程中发挥重要作用可能与其在蛋白质水平影响了Securin的表达密切相关。4肝硬化大鼠Tmub1蛋白表达水平较正常大鼠显著增高。5 Tmub1的下调能够改善肝硬化大鼠PH术后肝功能状态及肝细胞增殖情况。6四氯化碳致轻中度肝硬化模型下,IGF1 mRNA、HGF mRNA、C/EBP-βmRNA、 TGF-β1 mRNA、WT-1 mRNA显著增多,STAT3则明显下调。通过降低Tmub1的表达,各因子的表达状态均有改变,这可能是肝硬化模型下降低Tmub1表达能够改善PH术后肝功能状态、提高肝再生能力的重要原因。