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目的:肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,发现时多为晚期,多伴有慢性乙肝、肝硬化,对化疗放疗不敏感,使得肝癌患者预后不良。基因治疗技术的引入可望缓解肝癌症状并延长患者生命。但是,如何使治疗基因产物专一地杀伤肝癌细胞,而不损害正常的肝脏细胞及其他正常细胞,提高治疗效果,避免毒副作用,是肝癌基因治疗的瓶颈。甲胎蛋白是一个在哺乳动物发育过程中受到严格调节控制的蛋白质,在胚胎时期和肝细胞癌变时AFP基因表达特异性增高,表明肝细胞中有调控这个基因表达的系统。研究表明AFP基因起始密码子上游有7kb的调控序列。在这个调控区域有一个组织特异性启动子,三个独立的增强子,和一个沉默子。AFP阳性肝癌细胞中的非组织特异性转录因子和组织特异性转录因子共同作用于AFP的表达调控元件,使AFP的表达具有严格的时间空间特异性。我们将大鼠来源距离AFP起始密码子最远的增强子Ⅲ(-6.1kb～-5.8kb)及其下游的沉默子和启动子(-900bp～-1bp)进行优化组合,构建了1.2kb的基因表达调控序列,并将其克隆入去除CMV启动子的pEGFP-N1载体,取代pEGFP-N1质粒载体的启动子,构建了pAFP-EGFP质粒,将pAFP-EGFP转染AFP阳性人的肝癌细胞HepG2及AFP阴性的人的宫颈癌HeLa细胞和人的SMMC7721肝癌细胞以证明它在AFP阳性肝癌细胞中表达的相对专一性。同时为了验证这些序列在基因治疗中应用的可能性,我们在1.2kb调控序列下游,连接了抑癌基因P53 ,构建了pAFP-P53-EGFP,将pAFP-P53-EGFP转染AFP阳性人的肝癌细胞HepG2及AFP阴性的人的宫颈癌HeLa细胞和人的SMMC7721肝癌细胞以证明它在AFP阳性肝癌细胞中其具有相对专一的细胞周期阻滞和凋亡作用。方法:1构建去CMV的pEGFP-N1质粒1.1连接步骤如下:采用AseⅠ和NheⅠ在37℃将pEGFP-N1质粒的启动子CMV切除。1.2酶切后,胶回收4100bp的片段,采用平末端连接试剂盒,将4100bp的两个末端补平后进行连接。1.3将连接产物转化大肠杆菌DH5α中,加入800μl 2×YT培养基孵育60分钟,卡那平皿铺板,次日挑克隆,鉴定。2 pAFP-EGFP质粒的构建2.1提取SD大鼠肝脏细胞的DNA,以其为模板扩增甲胎蛋白( AFP )的启动子900bp和300bp增强子片段,同时通过引物设计在900bp片段两端引入SmaⅠ、EcoRⅠ酶切位点。300bp增强子片段两端引入Xhol、SmaⅠ酶切位点。2.2将900bp和300bpPCR产物分别胶回收后用SmaⅠ进行酶切,纯化,将纯化后片段在16℃进行连接。2.3连接产物1200bp做为模板进行PCR反应,将产物纯化后用EcoRⅠ和Xhol双酶切,与去CMV的pEGFP-N1质粒经EcoRⅠ和Xhol双酶切后产物进行连接。2.4将连接产物转化大肠杆菌DH5α中,加入800μl 2×YT培养基孵育60分钟,卡那平皿铺板,次日挑克隆,鉴定。3将构建好的pAFP-EGFP分别转染HepG2、SMMC7721、HeLa细胞,荧光显微镜下观察荧光蛋白表达强度。4 pAFP-P53-EGFP重组质粒的构建:4.1以pCMV-P53为模板,通过PCR反应克隆P53基因片段,并且在P53两端引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。4.2同时对P53的PCR产物和pAFP-EGFP进行双酶切,将酶切后载体和P53片段进行连接,得到pAFP-P53-EGFP重组质粒。5将构建好的pAFP-P53-EGFP重组质粒,转染HepG2、SMMC7721、HeLa细胞,以未转染的HepG2、SMMC7721、HeLa细胞做对照,用Western blot方法检测P53蛋白表达量的差异。6将转染pAFP-P53-EGFP重组质粒的HepG2、SMMC7721、HeLa细胞,用PBS洗涤后,70%的无水乙醇固定,流式细胞仪分析各组细胞周期和凋亡率。结果:1去CMV的pEGFP-N1质粒及pAFP-EGFP质粒,经酶切及PCR鉴定插入序列正确,构建成功。2 pAFP-EGFP分别转染HepG2、SMMC7721、HeLa细胞,荧光显微镜下观察荧光蛋白表达强度具有显著性差异,如图(Fig.8)所示。3 pAFP-P53-EGFP重组质粒经鉴定构建成功。4 Western blot方法检测转染pAFP-P53-EGFP的HepG2、SMMC7721、HeLa细胞,以及未转染的HepG2、SMMC7721、HeLa细胞P53蛋白表达差异,其灰度对数值分别为7.20±0.05、6.77±0.16、6.81±0.12、6.67±0.15、6.65±0.25、6.69±0.13。转染pAFP-P53-EGFP的HepG2细胞P53蛋白的表达量要明显高于转染的SMMC7721、HeLa细胞及未转染的HepG2、SM MC7721、HeLa细胞,说明在AFP启动子的驱动下,P53融合表达蛋白具有细胞相对专一性。5流式细胞分析法检测转染pAFP-P53-EGFP重组质粒的HepG2、SMMC7721、HeLa细胞周期时相和凋亡率的差异,HepG2组%gate=2.65±0.08、%G1=66.7±0.25、%G2=11.8±0.23、%S=20.1±0.22;HeLa组%gate=0.42±0.025、%G1=50.5±0.18、%G2=20.5±0.19、%S=29.8±0.18;SMMC7721组%gate=0.39±0.018、%G1=51.0±0.20、%G2=10.6±0.13、%S=37.8±0.21。由此可见转染pAFP-P53-EGFP重组质粒的HepG2细胞凋亡率及G1期细胞明显高于SMMC7721、HeLa细胞(p<0.05)。而HepG2的S期细胞明显低于SMMC7721、HeLa细胞(p<0.05)。结论:1 pAFP-EGFP表达具有细胞相对专一性,在HepG2细胞中表达强度要明显高于SMMC7721、HeLa细胞。2将转染pAFP-P53-EGFP重组质粒的HepG2、SMMC7721、HeLa,与未转染的HepG2、SMMC7721、HeLa经Western blot检测分析P53蛋白表达量,转染与未转染的均有P53表达,未转染的HepG2、SMMC7721、HeLa细胞P53表达无显著差异(P>0.05) ,而转染pAFP-P53-EGFP重组质粒的HepG2、SMMC7721、HeLa细胞中,HepG2的P53表达量最高,并且高于未转染的HepG2、SMMC7721、HeLa,进一步证明了pAFP-P53-EGFP表达具有细胞专一性。3流式细胞分析法检测转染pAFP-P53-EGFP重组质粒的HepG2、SMMC7721、HeLa细胞周期时相和凋亡率,HepG2的凋亡率及G1期明显高于SMMC7721、HeLa细胞,说明在AFP启动子驱动下P53凋亡及G1期细胞周期阻滞作用具有相对细胞专一性。