论文部分内容阅读
目的：（1）探讨CT-1(Cardiotrophin1)是否对hUCB-MSCs神经分化具有促进作用，寻找一种合适的细胞因子诱导hUCB-MSCs分化为神经样细胞，可能为神经系统疾病修复带来希望；（2）研究MAPK/ERK信号分子在hUCB-MSCs神经分化中的调控机制。方法：（1）分离、培养及鉴定hUCB-MSCs：收集人脐带血标本，用改良密度梯度离心法结合贴壁法分离脐血中单个核细胞，观察细胞形态变化并绘制生长曲线，用流式细胞术鉴定细胞表面标志物CD34、CD29、CD44和CD105的表达。（2）病毒转染：将Adv-CT-1及Adv-EGFP（腺病毒增强型绿色荧光蛋白）分别转染hUCB-MSCs，于转染后24h、48h、72h和96h用免疫荧光染色检测CT-1表达率，荧光显微镜下观察CT-1和EGFP转染成功率。（3）神经标志物及凋亡相关蛋白检测：免疫荧光分别检测对照组、EGFP组、CT-1组及NIM组Nestin、NeuN及MBP神经标志物表达；WesternBlot方法检测转染CT-1组及对照组调亡相关蛋白bcl2、Bax、Bak等表达情况。（4）免疫共沉淀法（CO-IP）及Western Blot法检测不同时间点hUCB-MSCs的CT-1受体（gp130和LIFRβ）及信号分子p-Raf-1、ERK1/2和p-ERK1/2表达；加入MEK抑制剂后Western Blot法检测Nestin、NeuN、MBP及p-ERK表达情况。结果：（1）hUCB-MSCs培养及鉴定：原代细胞培养第5d可见多角形细胞和大量大而圆的破骨样细胞及杂细胞，12d后可见大量梭形细胞呈集落样生长，平均28d可以传代。传代后约12h后细胞逐渐贴壁，细胞呈均一的梭形细胞，3-5d可再次传代，P3细胞得到形态均一，3-4d细胞融合率达90%。分离培养出hUCB-MSCs高表达间充质相关抗原CD105（89.31%）、整合素家族CD29（98.41%）、细胞黏附分子CD44（99.20%）、不表达造血干细胞标志CD34。（2）腺病毒转染：病毒转染率随着时间及MOI的改变而变化，病毒MOI为100PFU/细胞时，在转染72h，转染效率较高（87.60±1.36%）且细胞形态与生长方式与未感染细胞相同，为最佳转染复数。（3）CT-1对hUCB-MSCs神经诱导分化作用：诱导6h后CT-1组及NIM组即呈类神经细胞样形态改变，CT-1组变化更明显；4组中，CT-1组Nestin阳性率最高（86.82±4.29%），差异有统计学意义（P<0.05）；至第4d时，各组Nestin表达明显减少，CT-1组仍高于其他组，差异有统计学意义（P<0.05）；诱导后6h，CT-1组NeuN即有少量表达（14.26±2.20%），随后逐渐升高，第4d时阳性率达48.33±2.53%；CT-1组阳性率均高于其他各组（P<0.05）；诱导后6h，各组MBP均有少量表达，随后表达率逐渐升高，至第4d时阳性率最高，CT-1组6h（14.12±2.16%）及4d（45.63±2.78%）时MBP阳性率均高于其他各组，差异有统计学意义（P<0.05）；CT-1对bax、bak及caspase3等凋亡相关蛋白影响：Western Blot结果显示CT-1组bcl-2表达较对照组增加，CT-1组凋亡相关蛋白bax、bak、caspase3及caspase9表达（0.01±0.00，0.09±0.01，0.30±0.01，0.32±0.02）低于对照组（0.16±0.01，1.14±0.02，0.58±0.01，0.72±0.01），差异有统计学意义（P<0.05）。（4）不同时间点CT-1受体（gp130和LIFRβ）表达及ERK1/2、Raf-1磷酸化表达：转染后24小时，hUCB-MSCs可见p-Raf-1、p-ERK1/2及gp130微弱表达，未见LiFRβ表达；48h见LiFRβ微弱表达，p-Raf-1、p-ERK1/2及gp130表达增强，与24h相比有统计学意义（P<0.05）；72h时，gp130/LiFRβ及ERK1/2表达未见进一步增强；p-ERK1/2和p-Raf-1表达仍继续增加，与48h相比，差异有统计学意义（P<0.05）。加入不同浓度PD98059后ERK磷酸化、MBP、NeuN及Nestin水平变化：10umol/L PD98059可使MBP、NeuN、Nestin及p-ERK表达减少（P<0.05）；100umol/L PD98059可使MBP、NeuN、Nestin及p-ERK表达明显减少，与10umol//L组相比有统计学意义（P<0.05）。结论：（1）改良密度梯度结合贴壁培养法可以培养获得hUCB-MSCs；（2）Adv-CT-1可以高效转染hUCB-MSCs；（3）CT-1可以促进hUCB-MSCs向神经方向分化并抑制凋亡；（4）MAPK/ERK信号通路参与hUCB-MSCs神经分化的调控。