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目的:卵巢癌是导致女性癌症患者死亡的主要原因。已有许多药物用于治疗卵巢癌并可以改善患者的预后。以铂类为基础的化疗已成为局部晚期或转移癌患者的一线治疗方案,但临床化疗耐药性是晚期卵巢癌患者治疗的主要障碍,因此,如何逆转卵巢癌的化疗耐药性成为国内外研究的热点问题。长链非编码RNA是一类长度超过200个核苷酸的、不编码蛋白的RNA,已被证实为人类各种癌症发生与发展的调节因子。目前,许多测序技术已经表明LncRNAs在耐药和敏感的癌症细胞中存在差异表达,并通过细胞信号传导通路、DNA损伤修复作用、DNA甲基化等途径影响癌细胞对化疗药物的耐药性。因此,研究LncRNAs在肿瘤发生、发展以及放疗、化疗敏感性中的作用和潜在的分子机制具有重大的临床意义。同时,研究发现LncRNAs可作为内源性竞争性RNA,通过miRNA反应元件与microRNAs及其下游靶基因直接结合,互相调控彼此的表达水平和生物学功能。Linc00312,位于染色体3p25.3上,在多种疾病中的表达显着失调,并作为肿瘤抑制基因起着关键作用。此外,Linc00312通过与特定miRNA相互作用在细胞增殖、细胞凋亡、分化和转移中发挥重要作用。但Linc00312与卵巢癌化疗耐药性的关系及分子机制尚不清楚。本研究以Linc00312为研究对象,采用qRT-PCR与原位杂交技术深入了解其与卵巢癌化疗耐药性的相关关系;构建siRNA以及过表达质粒,通过CCK-8、流式细胞术、Western Blot等实验方法探索Linc00312逆转卵巢癌对顺铂化疗耐药性的作用机制;通过软件预测寻找其直接结合的microRNA及其靶基因,同时明确miR-196a-5p与ZMYND11在逆转卵巢癌对顺铂化疗耐药性中的作用以及三者之间的相关性,进而阐明Linc00312可通过抑制miR-196a-5p调控靶基因ZMYND11的表达,从而逆转卵巢癌对顺铂的化疗耐药性,为探索卵巢癌的治疗方法提供了新的思路。研究方法:第一部分:利用qRT-PCR与原位杂交检测Linc00312在卵巢浆液性癌组织中的表达,并通过对患者预后随访,统计Linc00312与卵巢癌临床病理生物学特征的相关性。qRT-PCR检测卵巢癌敏感细胞系SKOV3与耐药细胞系SKOV3/DDP中Linc00312的差异表达。分别转染Linc00312 siRNA和过表达质粒至SKOV3与SKOV3/DDP内,CCK-8检测经顺铂处理后细胞抑制率,并计算半抑制浓度IC50;流式细胞术检测细胞凋亡率;qRT-PCR与Western Blot检测耐药相关蛋白MDR1、MRP1以及细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9的mRNA与蛋白水平的变化情况。第二部分:通过软件预测分析寻找Linc00312相互作用的microRNA。利用qRT-PCR检测miR-196a-5p在卵巢浆液性癌化疗耐药与敏感组织和细胞中的差异表达,并利用Pearson相关性分析判断Linc00312与miR-196a-5p的相关关系。转染 miR-196a-5p mimics 与 inhibitor,利用 CCK-8、Annexin V-FITC 细胞凋亡实验、Western Blot检测miR-196a-5p与卵巢癌对顺铂化疗耐药的相关性。利用qRT-PCR检测Linc00312与miR-196a-5p之间的调控关系;进一步构建PMIR-Linc00312,通过荧光素酶报告基因实验检测Linc00312与miR-196a-5p的直接调控关系。第三部分:利用免疫组化与Western Blot检测ZMYND11在卵巢浆液性癌化疗耐药与敏感组织中的表达情况,并统计分析其与卵巢癌临床病理生物学特征的相关关系。利用qRT-PCR与Western Blot检测SKOV3与SKOV3/DDP细胞中ZMYND11的差异表达。转染ZMYND11 siRNA和过表达质粒,CCK-8、Annexin V-FITC细胞凋亡实验、Western Blot检测不同表达水平的ZMYND11对卵巢癌化疗耐药的影响。转染Linc00312 siRNA、过表达质粒以及miR-196a-5p mimics、inhibitor,利用Western Blot检测ZMYND11的蛋白水平变化,验证二者对ZMYND11 的调控作用。通过 TargetScan 预测 miR-196a-5p 与 ZMYND11 3’UTR 的结合位点,利用荧光素酶报告基因实验验证Linc00312可通过miR-196a-5p调控ZYMND11。结果:第一部分:Linc00312在卵巢浆液性癌化疗耐药组织中的表达显著低于化疗敏感组织,且主要在细胞浆中表达;其低表达与卵巢癌的FIGO分期有关,但与患者年龄、肿瘤分化以及淋巴结转移情况无明显相关性。Linc00312在卵巢癌化疗耐药细胞系SKOV3/DDP中的表达显著低于敏感细胞系SKOV3。抑制Linc00312的表达,顺铂处理后,SKOV3细胞抑制率降低、凋亡率减少,IC50由4.297±0.148ltg/ml增高至6.308±0.299μg/ml。耐药相关蛋白MDR1与MRP1、细胞凋亡相关蛋白Bcl-2mRNA与蛋白表达水平增高,而Bax、Caspase-3、Caspase-9表达水平显著降低。Linc00312过表达后,SKOV3/DDP则出现相反趋势。第二部分:miR-196a-5p在卵巢浆液性癌化疗耐药组织中的表达显著高于化疗敏感组织。与SK0V3相比,miR-196a-5p在SKOV3/DDP中表达增高。在SKOV3细胞中,与对照组相比,miR-196a-5pmimics组的细胞抑制率、凋亡率明显下降,顺铂对细胞的IC50升高;在SKOV3/DDP细胞中,与对照组相比,miR-196a-5p inhibitor组中的细胞抑制率、凋亡率显著增高,IC50降低。Linc00312与miR-196a-5p之间存在靶向结合位点,可负向调控彼此的表达水平,并共同抑制MDR1、MRPI蛋白表达,从而逆转卵巢癌对顺铂的耐药性。第三部分:与卵巢癌化疗敏感组织和细胞相比,ZMYND11在耐药组织和细胞中呈低表达,且其低表达与卵巢癌患者年龄、FIGO分期、肿瘤分化以及淋巴结转移情况无相关性。ZMYND11的低表达可使SKOV3细胞抑制率、凋亡率下降,IC50升高,MDRI、MRP1的表达增高;而在SKOV3/DDP细胞中高表达后,上述趋势刚好相反。敲低Linc00312的表达,ZMYND11的蛋白表达水平显著降低;而过表达Linc00312后,ZMYND11的蛋白表达水平亦随之升高。MiR-196a-5p与ZMYND11亦存在靶向结合位点;Linc00312与miR-196a-5p可共同调控ZMYND11的mRNA与蛋白表达水平,从而影响卵巢癌对顺铂的化疗敏感性。结论:第一部分:与卵巢癌化疗敏感组织与细胞相比,Linc00312在化疗耐药组织和细胞中呈低表达,且其低表达与卵巢癌的FIGO分期有关;Linc00312可通过Bcl-2/Caspase-3细胞凋亡途径逆转卵巢癌对顺铂的化疗耐药性;第二部分:miR-196a-5p在卵巢癌化疗耐药组织和细胞中呈高表达;Linc00312可通过抑制miR-196a-5p的表达逆转卵巢癌对顺铂的化疗耐药性;第三部分:ZMYND11在卵巢癌化疗耐药组织和细胞中呈低表达,其低表达与卵巢癌患者年龄、FIGO分期、肿瘤分化以及淋巴结转移情况无相关性;Linc00312通过miR-196a-5p调控靶基因ZMYND11的表达逆转卵巢癌对顺铂的化疗耐药性。