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绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)GP72是一株从青椒根际分离得到的生防根际促生菌,分泌吩嗪类化合物吩嗪-1-羧酸(PCA)和2-羟基吩嗪(2-OH-PHZ),其对植物病原真菌有很强的抑制作用,因此研究其合成的调控机制并通过分子生物学方法提高吩嗪类化合物产量具有重要的意义。前期研究显示,吩嗪的合成受到phzI/phzR双元调控系统的调控,phzI基因产生信号分子AHLs,和phzR产生的蛋白结合调控下游吩嗪合成基因簇的表达。通过对菌株GP72的全基因组DNA序列比对分析,发现其中包含基因aurI、csaI和hdtS,均有文献报道能合成AHLs,且双元调控系统aurI/aurR、csaI/csaR可能会调控吩嗪类化合物的产量。首先,以菌株GP72中的aurI、csaI、hdtS、phzI四个基因为研究对象,分别构建过表达质粒pBbB5k-aurI、pBbB5kk-csaI、pBbB5k-hdtS、pBbB5k-phzI,再转入大肠杆菌DH5α,获得四株表达菌株。pBbB5k是一个包含强启动子序列的表达载体,在IPTG诱导下才能启动下游基因表达。紫色杆菌CV026和根癌农杆菌NTL4可以作为指示菌检测AHLs,CV026对短链信号分子敏感,NTL4对长链信号分子敏感,用CV026和NTL4做显色实验,初步确定四个基因均能产生AHLs。aurI、csaI、phzI产生的信号分子能使CV026显紫色,NTL4显蓝色,而hdtS产生的信号分子只能使NTL4显蓝色,说明aurI、csaI、phzI可以同时产生长链信号分子和短链信号分子,hdtS只能产生长链信号分子。将四株表达菌株发酵,通过HPLC和LC-MS分析和确定发酵液中具体的信号分子种类。接下来构建了四个基因的敲除突变株GP72ΔaurI、GP72ΔcsaI、GP72ΔhdtS、GP72ΔphzI,发酵测定生长曲线和吩嗪类化合物产量。和GP72野生型相比,GP72ΔphzI突变株的吩嗪类化合物产量降为野生型的一半,GP72ΔaurI突变株的吩嗪类化合物产量是野生型的4倍左右,GP72ΔcsaI、GP72ΔhdtS突变株的产量和野生型无异,且四株突变菌株的生长曲线和野生型一致,说明phzI正调控吩嗪合成,aurI负调控吩嗪合成,csaI、hdtS基因虽然产生信号分子,但可能不调节吩嗪合成。为了研究双元调控系统aurI/aurR对吩嗪类化合物的合成影响,我们又构建了单敲菌株GP72ΔaurR、双敲菌株GP72ΔaurIΔaurR。发酵结果显示,GP72ΔaurI、GP72ΔaurR、GP72ΔaurIΔaurR的吩嗪类化合物产量均为野生株的4倍左右,说明aurI和aurR基因二者共同作用调控吩嗪产量。构建包含吩嗪合成启动子的转录融合质粒,其β-半乳糖苷酶活性可以反应吩嗪合成启动子的转录水平。测定β-半乳糖苷酶活性,突变株的酶活是野生型酶活的4倍左右,由此证明aurI/aurR双元调控系统共同作用负调控吩嗪合成。为了研究吩嗪合成基因簇的双拷贝对吩嗪类化合物产量的影响,在GP72野生型中过表达吩嗪合成基因簇,发酵48 h后吩嗪类化合物产量达到407 mg/L,提高23倍左右,证明增加基因簇的拷贝数可以使吩嗪类化合物产量提高。利用pUC18-mini-Tn7T-Gm载体,通过位点特异重组的方法,在假单胞菌特有的glms基因下游整合一个基因簇,测序验证后发酵测吩嗪类化合物产量。和野生株相比,含有双倍吩嗪合成基因簇菌株的吩嗪类化合物产量无明显提高,整合在glms基因下游的基因簇不表达。绿针假单胞菌GP72具有良好的生防应用前景,本论文在一定程度上阐释了GP72中的调控机理,为全面了解绿针假单胞菌GP72的群体感应调控系统及其对吩嗪合成的调控机制提供了理论依据,在此基础上我们可以设计遗传改造的靶标,构建高产吩嗪类化合物的工程菌株。