近年来,鲤疮疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV2)感染的流行对我国异育银鲫的养殖造成了严重的经济损失。该病原在中国大陆部分省市地区引起的疫情已受到越来越多的关注,特别是在江苏省主要水产养殖地区。此外,其它细菌性病原,特别是嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)也引起鲫鱼的出血性败血症。2015年,南京地区的部分异育银鲫饲养塘口相继出现了出血性败血症疫情。本试验采集病料42份,首先分离纯化细菌,基于气单胞菌DNA促旋酶B亚单位(gyrB)基因序列设计引物,PCR扩增后测序,进行细菌性病原的检测;同时,提取各病料样本基因组,PCR扩增CyHV2解旋酶(hel)基因,进行病毒性病原的鉴定。结果表明,28份检测样本有气单胞菌感染,其中6份为维氏气单胞菌(A.veronii),11份为简达气单胞菌(A.jandaei),3份为温和气单胞菌(A.sobria),8份为嗜水气单胞菌(A.hydrophila)。在42份病料中,34份为CyHV2阳性,其中在30份病死鲫鱼样本中,26份为CyHV2阳性;在12份临床健康鱼样本中,8份为CyHV2阳性,阳性率分别为86.66%和66.67%。其中值得注意的是,CyHV2和气单胞菌均阳性的样本共20份,占47.62%;两者均阴性的样本1份;CyHV2阴性而气单胞菌阳性的样本8份。结果表明,CyHV2和气单胞菌的混合感染是引起此次鲫鱼出血性败血症的主要致病原,其中,CyHV2的分布更为广泛。在病原鉴定的基础上,选择3株嗜水气单胞菌进行毒力测定,其对斑马鱼的半数致死量在1.4×103～3.7×103CFU/fish,且多位点序列分型显示均为ST251型。同时,采用差速离心结合蔗糖浓度梯度离心,进行了 CyHV2病毒粒子的纯化,电镜观察显示,在各浓度层及层交界处均有病毒粒子分布,特别是在25%与35%蔗糖溶液交界处和35%蔗糖溶液层CyHV2病毒粒子浓度及纯度均较高。为了鉴定CyHV2囊膜蛋白的抗原性,构建了 pET32a-ORF30重组质粒,并将构建成功的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,应用亲和层析和SDS-PAGE分别纯化和鉴定ORF30融合蛋白。结果显示,ORF30蛋白的最佳诱导表达条件为37℃,IPTG浓度为1mmol/L,诱导时间为5h。以融合蛋白和纯化病毒悬液分别免疫ICR小鼠和新西兰家兔,获得小鼠和兔血清的ELISA抗体效价可达1:12800以上。Western blot结果显示纯化后的ORF30融合蛋白可与CyHV2多克隆抗体特异性结合,表明ORF30基因编码的囊膜蛋白具有较好的免疫原性和反应原性,为建立CyHV2快速检测方法及研制亚单位疫苗提供了物质基础。