【摘 要】
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紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是具有丰富营养价值的优质牧草,被全世界广泛种植。然而低温、盐渍、干旱等多种逆境胁迫严重的制约着作物的生长,造成作物大幅度减产,对作物的生存构
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紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是具有丰富营养价值的优质牧草,被全世界广泛种植。然而低温、盐渍、干旱等多种逆境胁迫严重的制约着作物的生长,造成作物大幅度减产,对作物的生存构成威胁,导致植被和生态环境的退化。因此,选择优良的抗逆相关基因通过基因工程手段,培育抗逆型更强的紫花苜蓿新品种,不仅能够为苜蓿的遗传育种研究奠定坚实的理论基础,同时还会促进当今畜牧业发展。本试验建立了黑龙江省主栽的苜蓿品种“敖汉”和“龙牧801”的下胚轴再生系统,并以“敖汉”下胚轴再生系统作为核苷二磷酸激酶2基因(AtNDPK2)转化的受体,通过农杆菌EHA105介导法转化,对获得的转基因苜蓿植株进行了分子生物学检测和盐胁迫分析,所获得的结果如下:1“.敖汉”和“龙牧801”两个品种的下胚轴都能在改良的SH基本培养基上诱导出愈伤组织,2mg·L-12,4-D和0.15mg·L-1KT的配合使用促进了胚性愈伤组织的形成,0.1mg·L-1KT有利于胚性愈伤的分化,获得的“敖汉”愈伤组织诱导率为100%,胚性愈伤分化率为53.3%;“龙牧801”愈伤组织诱导率为98.3%,胚性愈伤分化率37.5%;1/2MS有利于生根,两者生根率分别达到了100%;2.转化体系中抗生素压力筛选过程发现350mg·L-1头孢霉素(Cef)就能够有效抑制农杆菌EHA105生长,50mg·L-1卡那霉素(Kan)不影响下胚轴形成胚性愈伤;抗生素选择压确定过程发现:下胚轴对Cef不敏感,胚性愈伤组织诱导率不受Cef浓度影响;而下胚轴对Kan敏感,高浓度的Kan抑制胚性愈伤组织的形成;研究预培养,共培养时间及筛选方式对抗性体胚诱导率的影响发现:5d预培养,2d共培养及延迟的筛选方式获得的抗性体胚率是最高的,获得的最终转化率为23.3%;3.将获得的23株转基因植株经PCR初步检测,有20株目的基因已整合入染色体基因组中。在不同浓度的NaCl胁迫下,测定转基因植株与对照植株叶片中SOD、POD活性及丙二醛含量,发现转基因植株与对照植株相比在0.4%~1.0%NaCl胁迫下SOD,POD活性显著升高,丙二醛含量降低,充分说明了AtNDPK2基因的遗传转化增强了苜蓿植株对盐胁迫的忍耐性。
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