水稻是重要的粮食作物,也是重要的单子叶模式植物。农杆菌介导的遗传转化技术是研究水稻功能基因组学最常用的手段之一,而建立稳定、高效的组织培养转化系统是其前提和基础。影响水稻组织培养的因素很多,例如外植体的取材季节、取材部位、生理状态、基因型、培养基中盐类的组成及浓度、有机添加物的种类、生长调节剂的不同组合及配比等。氮源是组织培养培养基中必不可少的成分,但亚硝酸盐能否作为培养基的氮源成分未见报道,本研究系统分析了不同氮源对水稻愈伤组织生长和发育的影响,获得的主要研究结果如下:以不同组合的硝酸盐、亚硝酸盐、铵盐、谷氨酰胺作为培养基氮源,以愈伤组织的诱导重量、继代增重倍数和分化率作为生长评价指标,检测不同氮源对水稻愈伤组织的表型影响。结果显示铵盐和谷氨酰胺单独或一起作为氮源均不能诱导愈伤组织形成、愈伤组织继代的增重倍数较低、愈伤组织不能分化成苗,其中铵盐在分化过程中甚至不能使愈伤组织转绿,而低浓度的亚硝酸盐（2 mM、5 mM）作为氮源效果优良,在排除了钾盐和可能存在的硝酸盐污染后,明确了NO₂^-发挥作用的可靠性。检测不同的培养阶段、不同的氮源培养基对愈伤组织中可溶性蛋白、硝酸盐含量、亚硝酸盐含量的影响。结果显示不同氮源培养基上培养的愈伤组织中可溶性蛋白含量不受氮源影响;在继代和分化阶段,以亚硝酸盐或硝酸盐作为氮源的培养基上培养的愈伤组织中亚硝酸盐的含量在前三天有明显升高、第三天达到峰值、之后呈下降的趋势,而仅以铵盐或谷氨酰胺作为氮源的培养基上培养的愈伤组织中亚硝酸盐含量无显著变化;在一定的浓度范围内,愈伤组织中亚硝酸盐的含量与其生长指标正相关,而硝酸盐的含量与生长指标不相关。钨酸钠特异性抑制硝酸还原酶（nitrate reductase,NR）的活性,利用此原理设计实验,结果表明随着培养基中钨酸钠浓度的升高,对以硝酸盐作为氮源的愈伤组织生长发育的抑制作用越大,其原因是细胞内亚硝酸盐含量的逐渐降低;而钨酸钠浓度的升高对以亚硝酸盐作为培养基氮源的愈伤组织的生长发育无显著性抑制,其原因是细胞内亚硝酸盐含量无显著变化。以受硝酸盐诱导表达的四个基因为代表,检测它们在不同氮源培养基上进行继代和分化培养的愈伤组织中的表达情况。结果显示它们在以硝酸盐或亚硝酸盐作为氮源的愈伤组织中高表达,而在仅以铵盐作为氮源的愈伤组织体内低表达,表明亚硝酸盐可能是真正诱导这些基因表达的物质,而非硝酸盐。根据以上所有实验结果推测,亚硝酸盐极有可能对水稻愈伤组织的形态建成起信号分子的作用,而非硝酸盐。检测培养基的硝铵比对水稻愈伤组织的表型及其体内亚硝酸盐含量的影响,仍以愈伤组织的诱导重量、继代增重倍数和分化率作为生长评价指标,结果显示在总氮量相同的情况下,粳稻中花11（简称ZH11）的愈伤组织在硝铵比为4:1时生长最好,同时愈伤组织中亚硝酸盐的含量最高;籼稻9311的愈伤组织在硝铵比为2:1时生长最好,同时愈伤组织中亚硝酸盐的含量最高。根据经验,N6培养基是粳稻组织培养最常用的培养基,MS培养基及其改良培养基是籼稻组织培养最常用的培养基,而培养基之间最大的不同即在于无机总氮量和硝铵比的不同,N6和MS培养基的硝铵比分别是4:1和2:1。上述实验结果可为此经验做法提供一个解释,即不同的硝铵比极可能影响了愈伤组织中亚硝酸盐的含量,而亚硝酸盐作为某种与生长发育有关的信号分子最终影响了愈伤组织的表型性状。确定愈伤组织中一氧化氮（NO）与亚硝酸盐的上下游信号分子的关系。实验结果显示,愈伤组织中NO的含量与亚硝酸盐含量正相关,体外添加浓度逐渐增大的亚硝酸盐导致酶上清液中检测到NO特异性荧光成比例的增加,说明亚硝酸盐很可能是愈伤组织中NO的主要来源。若除去愈伤组织中的NO,则成熟胚无法诱导出愈伤组织、愈伤组织不能分化,说明NO极可能也是水稻组织培养中一种与生长发育有关的信号分子。在9311愈伤组织继代培养过程,NO供体亚硝基铁氰化钠（SNP）可以调节愈伤组织中NO的含量,以SNP、SNP+谷氨酰胺、SNP+铵盐作为培养基氮源对愈伤组织的继代增重倍数无显著性影响,但SNP+亚硝酸盐作为培养基氮源对愈伤组织的继代增重倍数有显著性提高,表明NO在亚硝酸盐的下游发挥作用,愈伤组织中合适浓度的亚硝酸盐是NO发挥作用的前提。为了解培养基中亚硝酸盐的添加对愈伤组织转录组的影响进行了 RNA-seq转录组测序。在继代过程,亚硝酸盐对有关苯基丙烷类物质合成的次级代谢通路影响大,造成多数基因下调表达,这与体外检测亚硝酸盐降低愈伤组织木质素含量的结果相符,木质素的降低有利于愈伤组织向胚性化方向发展。在分化过程,仅以亚硝酸盐为氮源的愈伤组织中与逆境、胁迫、病害相关的基因大多会上调表达,α-淀粉酶前体基因上调表达,同时它对激素合成、代谢及细胞壁合成相关基因表达有很明显影响。综上所述,本研究进行了亚硝酸盐在水稻组织培养中的开拓性工作,重新认识了亚硝酸盐在植物组织培养培养基中的作用,证实亚硝酸盐不仅可以作为水稻组织培养的氮源营养成分,同时极有可能作为信号分子参与愈伤组织表型性状的调控,这对水稻组织培养具有重要的理论意义和应用价值,其相关的分子转导途径有待进一步地研究。