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研究背景随着生活水平提高和生活方式的转变,我国冠心病发病率逐年升高。虽然目前的临床治疗技术的进步使心肌梗死的早期死亡率明显降低,但是心肌梗死患者往往会出现生活质量下降,并最终发展成有症状的心力衰竭。其根本原因在于心肌梗死伴随心肌细胞数量减少(死亡或凋亡),心脏结构的病理性重塑,最终心功能进行性的恶化。因此深入研究解决因细胞数量减少导致的心脏病理生理改变的新途径,对提高心肌梗死患者存活率和生存质量具有重要意义。目前Hippo信号系统对哺乳动物的器官发育水平控制的研究是热点。已有的研究提示Hippo信号系统在哺乳动物的肝脏等发育过程中起关键作用,但是有关Hippo信号通路在心脏中的研究较少,且Hippo信号系统对心脏发育和心肌细胞增殖的调控机制仍然不明确。研究目的本课题将通过观察大鼠出生后心肌细胞增殖能力转变过程中Hippo信号系统关键组分的表达变化及通过Hippo信号关键组分过度表达或表达不足分别对大鼠H9C2心肌细胞系增殖影响的研究,进一步阐明Hippo通路对心肌细胞增殖的调控作用,从而为后续的心肌梗死后心肌细胞再生治疗开拓新思路和提供必要的理论依据。研究方法研究内容分两部分：(1)观察大鼠出生后各周龄心肌组织中Hippo信号系统关键组分YAP、P-YAP及其上游组分LATS1/2的表达变化。应用RT-PCR法和Western Blot方法检测Hippo信号系统关键组分YAP、磷酸化YAP (P-YAP)及其上游组分LATS1/2的在大鼠出生后各周龄心肌组织中的表达变化；应用免疫组化方法包括DAB染色和免疫荧光激光共聚焦研究YAP,P-YAP及LATS1/2在细胞内的定位及表达特点。(2)通过Hippo信号关键组分过度表达或表达不足观察大鼠H9C2心肌细胞的增殖行为。我们通过构建含LATS1的质粒即pIRES2-EGFP-LATS1,过度表达Hippo信号关键组分LATS1,借助EDU掺入增殖实验和CCK8增殖检测法观察大鼠H9C2心肌细胞的增殖变化；同时通过设计和筛选针对YAP和LATS1的小干扰RNA (siRNAs)观察大鼠H9C2心肌细胞的增殖变化。研究结果(1)同出生1d的大鼠心脏组织相比,在出生后1w、2w、4w、6w和8w的大鼠心脏组织中,YAP基因的mRNA和蛋白水平未见明显变化,且在细胞核内和细胞质中都有表达；但是P-YAP随着周龄增加在心肌细胞内的表达增加,且主要定位在核内。随着周龄增加,LATS1在心肌细胞内的表达增加,同时核内表达尤其明显,其表达特点与p-YAP相似。但是LATS2的表达在大鼠出生后各周龄未见明显变化,且LATS2在细胞内表达主要在细胞质。(2)本文针对YAP和LATS1基因设计了若干对siRNAs,利用RT-PCR反应和蛋白印迹验证。经转染H9C2心肌细胞系后,发现siLA1组相对于siCON对照组Edu阳性细胞比例及OD值有明显的增多(P<0.05),而siYAP组EdU阳性细胞比例和OD值相对于siCON对照组Edu阳性细胞比例有明显减少(P<0.05)。(3)应用分子克隆技术,我们成功构建了含有LATS1的真核表达载体。经过转染和G418筛选而稳定表达后,我们发现pIRES2-EGFP-LATS1重组质粒实验组EdU阳性细胞比例及OD值相对于空白质粒对照组有明显的降低(P<0.05)。研究结论Hippo信号系统在大鼠出生后心肌细胞增殖潜能转变过程中起着重要作用。Hippo信号通路通过调控关键组分蛋白YAP磷酸化水平调节心肌细胞增殖能力,而且大鼠心肌细胞通过核内磷酸化YAP而非经典的核外磷酸化途径作用。LATS1在磷酸化YAP的过程中起着重要作用。该研究阐明了Hippo通路对心肌细胞增殖的调控作用,为后续的心肌梗死后心肌细胞再生治疗开拓新思路和提供必要理论依据。