【摘 要】
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目的:探讨miRNA-27b靶向EPAS1调控内皮祖细胞参与血管生成的机制,为牵张成骨的机制研究提供理论依据。方法:1.抽取幼犬骨髓,采用密度梯度离心法及差速贴壁法分离培养内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells,EPCs）,并对其进行形态学观察,DIL-FITC双荧光染色鉴定,以及增殖、迁移、成血管能力的检测。2.构建miRNA-27b模拟物、抑制剂及阴性对照物慢病毒
【基金项目】
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项目名称:lncRNA和MicroRNA调控胚胎内皮祖细胞Notch、BMP、Wnt信号通路参与牵张成骨血管发生的机制研究,项目合同编号:81870748,项目来源:国家自然科学基因面上项目,项目起止时间:2019-01至2022-12
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目的:探讨miRNA-27b靶向EPAS1调控内皮祖细胞参与血管生成的机制,为牵张成骨的机制研究提供理论依据。方法:1.抽取幼犬骨髓,采用密度梯度离心法及差速贴壁法分离培养内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells,EPCs）,并对其进行形态学观察,DIL-FITC双荧光染色鉴定,以及增殖、迁移、成血管能力的检测。2.构建miRNA-27b模拟物、抑制剂及阴性对照物慢病毒载体,将EPCs分为不转染慢病毒的正常组（control group,CTRL组）、转染miRNA-27b模拟物慢病毒组（mimics group,mimics组）、转染miRNA-27b模拟物阴性对照慢病毒组（mimics negative control group,mimics NC组）、转染miRNA-27b抑制剂慢病毒组（inhibitor group,inhibitor组）、转染miRNA-27b抑制剂阴性对照慢病毒组（inhibitor negative control group,inhibitor NC组）。测定慢病毒感染EPCs的最佳MOI,qRT-PCR检测miRNA-27b基因过表达及沉默效率,建立miRNA-27b沉默和过表达的犬EPCs细胞模型。3.分别使用流式细胞周期、CCK-8法、transwell穿膜实验以及matrigel小管形成实验检测过表达及沉默miRNA-27b基因对EPCs细胞周期、增殖、迁移及血管形成能力的影响。4.使用qRT-PCR检测不转染慢病毒的正常组、转染miRNA-27b模拟物慢病毒组、转染miRNA-27b模拟物阴性对照慢病毒组、转染miRNA-27b抑制剂慢病毒组、转染miRNA-27b抑制剂阴性对照慢病毒组,五组EPCs中AGGF1、EPAS1（HIF-2α）、BMPR2以及成血管标志物VEGF-A、bFGF的表达。5.使用Western blot方法检测以上五组EPCs中AGGF1、EPAS1（HIF-2α）、BMPR2及成血管标志物VEGF-A、bFGF蛋白的表达。6.构建野生型BMPR2 3’UTR和突变体BMPR2 3’UTR的荧光素酶报告基因载体,检测miRNA-27b对BMPR2的调控作用。7.构建野生型EPAS1 3’UTR和突变体EPAS1 3’UTR的荧光素酶报告基因载体,检测miRNA-27b对EPAS1的调控作用。结果:1.成功培养及鉴定了幼犬骨髓源性内皮祖细胞,EPCs可吞噬Dil-ac-LDL,并且结合FITC-UEA-1。EPCs在体外具有较强的增殖、迁移及形成新生血管的能力。2.构建miRNA-27b模拟物、抑制剂及阴性对照物慢病毒载体,将慢病毒转染内皮祖细胞,72小时后在显微镜下可见EPCs荧光表达效率80%左右,细胞生长良好。检测miRNA-27b基因过表达及沉默效率发现,与CTRL组、mimics NC组比较,mimics组的miRNA-27b表达上升。与CTRL组、inhibitor NC组比较,inhibitor组的miRNA-27b表达下降,且具有统计学意义（P0.05）。过表达miRNA-27b后,EPCs中EPAS1、BMPR2、VEGF-A、bFGF的表达水平下降,沉默miRNA-27b后EPCs中EPAS1、BMPR2、VEGF-A,bFGF的表达水平上升,且差异均有统计学意义（P0.05）。上调EPCs中miRNA-27b基因表达量后,EPAS1、BMPR2、VEGF-A、bFGF的蛋白表达水平下降;下调EPCs中miRNA-27b基因表达量后,EPAS1、BMPR2、VEGF-A、bFGF的蛋白表达水平上升,上述差异均有统计学意义（P0.05）。且共转染miRNA-27b mimics和突变型BMPR2 3’UTR萤光素酶报告基因载体后也不影响萤光素酶活性（P>0.05）。说明本实验中miRNA-27b与BMPR2两者间不存在结合作用。7.成功构建及鉴定野生型EPAS1 3’UTR和突变型EPAS1 3’UTR的荧光素酶报告基因载体。与对照组相比,共转染miRNA-27b mimics和野生型EPAS1 3’UTR报告基因载体后,萤光素酶活性明显降低（P0.05）。说明miRNA-27b与EPAS1之间存在结合作用,miRNA-27b可靶向作用于EPAS1。结论:体外培养的EPCs具有较强的增殖、迁移及形成新生血管的能力。通过构建慢病毒质粒沉默或过表达EPCs中的miRNA-27b,表明了miRNA-27b能够通过负调控其靶基因EPAS1抑制EPCs的血管生成能力,其机制可能与激活HIF/VEGF信号通路有关。
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