血管瘤是小儿最常见的以血管内皮细胞增生为特点的良性肿瘤,增殖期血管瘤伴有毛细血管内皮细胞过度增殖和过多的肥大细胞。临床上多在学龄期自然消退,但其发病机制还不清楚。血管瘤的治疗方法很多,但疗效不很确切。研究血管瘤的发病机制及相关药物的作用机制,不仅能为防治血管瘤提供帮助,同时也有助于其它各种血管畸形、淋巴瘤等血管疾病的治疗。目前对平阳霉素（Pingyangmycin,PYM）和地塞米松（Dexamethason,DX）治疗血管瘤的知识主要来自于临床疗效观察和少数细胞水平的研究,其中研究所选细胞多数为正常血管的内皮细胞（Endothelial cell,EC）系,与增生期血管瘤内皮细胞（Hemangiomaendothelial cell,HEC）增殖活跃是不同的,因此其研究针对性欠强。而有关内皮抑制素（endostatin）的研究主要见于肿瘤的研究,未见到将其应用于血管瘤治疗的相关研究。本研究通过体外培养HEC和人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）,并建立三维血管瘤血管生成模型及血管瘤裸鼠移植模型,将目前临床常用的PYM和DX应用于两种EC,进行干预实验,以期观测这两种药物药效及作用机制。同时将重组人血管内皮抑制素（rh-endostatin,YH-16）这种抗肿瘤药物初步应用于HEC、HUVEC,观察其对血管瘤有无治疗作用及其作用机理。观察三维血管瘤血管生成模型和血管瘤裸鼠移植模型,以期为进一步研究血管瘤提供可行的离体和在体模型。血管瘤主要是由于内皮细胞的过度增生引起的,对瘤体组织学观察为研究血管瘤的组织发生提供了基础。本实验对血管瘤及其内皮细胞在组织和细胞水平上进行了初步研究,从而有益于血管瘤的进一步研究,也为发现更好的临床治疗药物或其它有效治疗措施提供了依据。全文包括三部分内容。第一部分体外培养HEC、HUVEC,建立三维血管瘤血管实验一HEC、HUVEC的体外培养和鉴定目的:体外培养及鉴定HEC、HUVEC。方法:1.HEC培养:取新鲜小儿增生期草莓状血管瘤组织标本,以组织块法进行原代培养,并常规传代培养;2.HUVEC培养:取产后的新鲜脐带,用胰酶和胶原酶消化方法获取HUVEC进行体外培养。用含10%胎牛血清的M199培养液在含0.5%CO₂、37℃、饱和湿度的培养箱中培养,每隔两天换液,待长成单层细胞后传代培养,观察其生长、增殖特征。普通光学显微镜观察细胞生长情况,并用链霉抗生物素蛋白——过氧化酶反应（SP免疫组化法）测定内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原（vWF）在其内的表达情况、透射电镜检测来鉴定EC。将皮肤血管瘤组织制成石蜡切片后进行常规HE染色,观察其组织病理学特点。结果:培养的EC表现为接触抑制生长,呈单层生长,多角形镶嵌排列,细胞的中央有明显的椭圆形核,集落之间相互融合连接成片,呈典型的“鹅卵石”样排列。细胞内vWF呈阳性表达,超微结构显示出细胞质内含有EC特征性Weibel-Palade小体（W-P小体,呈点状或卵形）。皮肤血管瘤组织制成石蜡切片后进行常规HE染色,观察发现细胞核呈蓝色,胞浆为淡红色,管腔内红细胞呈橘红色。组织局部核密集,说明细胞以该位置作为生发点,不断增生,向内侵袭,形成新的血管腔,小血管明显增生。结论:用组织块法及酶消化法分别原代培养增殖期HEC和HUVEC,均可获得纯度较高的EC。实验二三维血管瘤血管生成模型的建立并初步应用目的:建立三维血管瘤血管生成体外培养模型并初步应用。方法:将新鲜的增殖期血管瘤标本剪成1mm×1mm×1mm的组织块置于纤维蛋白凝胶中以双层夹心法进行培养。将纤维蛋白原（终浓度为2mg/ml）溶于含庆大霉素（100U/ml）、氨基己酸（0.3mg/ml）及10%胎牛血清的MCDB131培养液中,加凝血酶（0.5U/ml）后,迅速加入96孔培养板的培养孔中,约5min后形成下层凝胶（量约0.5ml）,植入1mm³的组织块,于其上层加入上述混合液形成上层凝胶（量约0.8ml）,置于37℃含5%CO₂的潮湿孵箱中3-5h或过夜,再加含庆大霉素、链霉素、氨基己酸及10%胎牛血清的MCDB131培养液1ml。将培养板置于37℃含5%CO₂的潮湿孵箱中,3d换一次培养液,并于血管新生后2～3d时加入PYM做干预实验。光学显微镜及荧光显微镜下观察血管生成情况,SP免疫组化法检测内皮细胞vWF、透射电镜观察内皮细胞超微结构鉴定新生血管。结果:血管瘤组织培养4～7d后芽生出细小血管,至第8～10天长成枝丫状血管样结构,第11～14天之后血管样结构生长渐缓停滞萎缩。平阳霉素作用1-2d后血管样结构很快萎缩。组织周边新生树枝状结构经石蜡切片HE染色、血管内皮细胞特异性标志物vWF检测及电镜观察鉴定为血管内皮细胞。结论:该模型的建立部分程度上可代表血管生成、萎缩的过程,但此模型芽生出细小血管样结构的时间不等,萎缩较快,与体内血管瘤血管仍有很大区别,尚需进一步研究完善。实验三血管瘤裸鼠移植模型的建立目的:建立血管瘤裸鼠移植模型。方法:选择新鲜的增殖期血管瘤皮下部分,切成5mm×4mm×3mm的小块,分别经皮肤切口置入8只裸鼠两侧颈背侧、胸背侧、腰背侧及臀部皮下,每只8处,共64处。移植工作在标本离体后1h内完成。动物模型建立后自然生长,移植后每周测量移植物的大小及第10、12、14、16w切取移植瘤行组织HE染色及SP免疫组化染色检测内皮细胞vWF。结果:血管瘤组织裸鼠移植术后3～4w内,瘤体基本无明显变化。40d后,部分瘤体开始略增大（P＞0.05）,60d后瘤体体积保持不变或轻微缩小。90d时可见部分瘤体颜色变浅,质地较前变硬。120d时部分瘤体仅有少许残留组织。HE染色切片示移植后10w时部分EC胞质内出现较大而圆的空泡,EC数量减少。12w时EC周围可见较多胶原纤维（collagen fiber,CF）、成纤维细胞（fibroblast,FB）等间质细胞分布。可见EC聚集成团,围成大小不同血管腔,管腔受压变形,EC形态多样。14w时CF和FB减少,分布不均匀。EC密度降低,较多坏死。部分聚集成团,其细胞形态与人血管瘤来源标本相似。16w时EC数量明显减少,分布稀疏,部分血管腔内血栓形成并机化,EC胞质脱落。CF和FB大量分布。vWF免疫组化染色阳性。结论:采用单纯的血管瘤组织块进行裸鼠移植,操作简便,但瘤体基本无明显增大阶段,而且多纤维包裹吸收,其生长过程与临床实际状态存在较大差异,难以作为血管瘤研究的较理想的动物模型,因此还需要今后进一步摸索寻找合适的血管瘤动物模型。第二部分YH-16、PYM、DX对体外培养的HEC、HUVEC生长的作用目的:探讨YH-16、PYM、DX对体外培养的HEC、HUVEC生长的影响作用机理。方法:将不同浓度的YH-16、PYM、DX作用于3～5代生长旺盛的EC,以MTT法检测细胞活性并筛选有效浓度。以有效浓度的YH-16、PYM、DX作用于EC,在不同时相点光镜下观察EC形态,MTT检测细胞活性,流式细胞术检测细胞周期并计算细胞增殖指数（PI）。结果:各种药物作用后,光镜下可见EC发生坏死改变。MTT检测显示吸光度降低（P＜0.05）。流式细胞术检测示在三种药物作用下,两种内皮细胞G₁期细胞比例增多（P＜0.05）,以YH-16组的最为明显;S期细胞比例下降,在HUVEC组下降明显（P＜0.05）,其中YH-16对HUVEC的作用明显;而G2期细胞比例在HUVEC组增高（P＜0.05）,在HEC组则下降（P＜0.05）。两种细胞的PI均降低（P＜0.05）。结论:1.YH-16通过:①主要作用于EC G₁期,抑制DNA合成,降低细胞增殖活性,减少细胞数量;②诱导凋亡;③改变ECs细胞形态,阻止其融合、粘连,达到抑制血管管腔的形成。YH-16抑制DNA合成的作用较PYM和DX强。2.PYM通过:①作用于EC的G₁期,使DNA合成受阻,从而抑制EC的生长增殖;②诱导凋亡;③对DNA的直接损伤作用参与了细胞周期阻滞作用;④直接杀伤EC,使细胞崩解,细胞连接破坏,从而阻抑血管生成。PYM对HEC的抑制作用强于对HUVEC抑制作用。3.DX通过:①作用于EC G₁期,抑制DNA合成,降低细胞增殖活性,减少细胞数量;②诱导凋亡;③对EC DNA的直接损伤作用参与了细胞周期阻滞作用:④使细胞皱缩成圆形,细胞连接中断,间隙增大,从而抑制血管生成和中断血管的连续性。DX对HEC的抑制作用较对HUVEC强。4.三种药物均可以诱导EC凋亡。相比较,PYM对HEC的抑制作用最强,YH-16对HUVEC的抑制作用最强。第三部分YH-16、PYM、DX对体外培养的HEC、HUVEC分泌VEGF、MMP-2、Shh的影响目的:研究YH-16、PYM、DX对体外培养的HEC、HUVEC分泌VEGF、MMP-2、Shh的影响。方法:以有效浓度的YH-16、PYM、DX作用于3～5代生长旺盛的EC,采用实时荧光定量多聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-FQ-PCR）检测VEGF、MMP-2及Shh的表达量。结果:1.在各种药物作用下,HEC和HUVEC中VEGF、MMP-2、Shh表达量均降低（P＜0.05）;2.HEC中Shh高表达,HUVEC中Shh极低表达（P＜0.05）;3.在HEC中Shh表达量明显高于VEGF和MMP-2的表达量（P＜0.05）。结论:1.YH-16、PYM、DX均可抑制HEC和HUVEC中VEGF、MMP-2、Shh基因的表达。2.VEGF、MMP-2和Shh三种因子之间具有显著相关性。提示VEGF、MMP-2和Shh各因子之间存在相互影响的作用,每种因子量的变化都会影响到另外两种因子的表达。3.HEC中Shh高表达,HUVEC中Shh极低表达。说明Shh在血管瘤形成中具有重要的作用。在分子生物学水平,Shh基因有可能作为区分血管瘤和血管畸形的一项指标,同时也可能成为未来血管瘤基因治疗的靶向基因。