本研究通过盲式细针滑膜活检术获取RA滑膜组织，体外分离、培养、纯化成纤维样滑膜细胞，在常氧或低氧条件下予不同浓度的西罗莫司干预，采用逆转录—聚合酶链反应(RT—PCR)及间接免疫荧光方法检测FLS的HIF-1α、VEGFmRNA及蛋白的表达，探讨西罗莫司对低氧条件下RA FLS HIF-1α及VEGF表达的影响。 研究目的: 分离、培养、纯化活检滑膜组织成纤维样滑膜细胞，建立高效的原代培养技术。 材料和方法: 临床确诊的RA活动期的患者，膝关节盲式细针滑膜活检术获取滑膜组织，分别采用消化酶培养法、组织块培养法、改良组织块培养法进行FLS原代培养，并进行形态学及免疫细胞化学染色鉴定。 结论: 消化酶培养法、组织块培养法、改良组织块培养法均能成功培养出活检滑膜组织FLS，其中改良组织块培养法因所需标本量少，特别适合盲式细针滑膜活检术的标本，同时操作简单，降低细胞污染的风险，减少原代细胞的损耗而更有应用价值。 第二章西罗莫司对低氧诱导下类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞HIF-1α及VEGF表达的影响 研究目的: 探讨西罗莫司对低氧诱导下RA FLS HIF-1α及VEGF表达的影响，进一步阐明RA新牛血管形成的发病机制，为RA的治疗提供新的选择。 材料和方法: 1.MTT法检测西罗莫司对RA FLS细胞增殖的影响，西罗莫司10nmol/L和100nmol/L处理RA FLS24h，全自动酶标分析仪在492波长下测定吸光度。 2.体外培养的第三代RA FLS随机分为常氧组和低氧组，低氧组细胞分别予低氧刺激3h、6h、12h，收集细胞用RT—PCR方法检测低氧条件下滑膜成纤维细胞HIF-1α mRNA和VEGF mRNA表达水平。 3.西罗莫司10nmol/L、100nmol/L分别预处理RA FLS细胞12h后，再予低氧刺激，观察西罗莫司对低氧条件下RA FLS HIF-1αmRNA和VEGF mRNA表达水平的影响。 4.RA FLS爬片后随机分为常氧组、低氧组和西罗莫司组(西罗莫司100nmol/L预处理细胞12h)，间接免疫荧光方法检测RA FLS的HIF-1α蛋白表达。 5.统计学处理 所有数据处理均采用SPSS13.0统计软件包进行统计学处理。正态分布资料以均数±标准差(x±s)表示；多组间均数的比较采用单因素方差分析(One—Way ANOVA)；半定量资料两组间比较采用Mann—Whitney秩和检验。显著性水准为0.05。 结论: 1.低氧可能通过诱导RA FLS HIF-1α蛋白表达及核转位，从而促进VEGF mRNA表达升高。 2.西罗莫司可能通过转录后水平抑制低氧诱导的RA FLS HIF-1α蛋白表达及核转位，进而抑制VEGF mRNA表达。