代谢组学技术的发展为中国传统医药学的现代化研究提供了一种选择,将代谢组学技术应用到中医证候诊断和复方中药药效评价方面具有广阔的前景。本课题将代谢组学的方法应用于中医药的研究,以中医中常见的肾虚证作为研究对象,通过高剂量氢化可的松诱导的大鼠建立模型,选择六味地黄方作为干预的复方中药,分别应用NMR,LC-MSn,LC-TOF/MS,GC-MS对大鼠尿液和血浆样品进行分析,结合模式识别方法进行分类和寻找标记物,并解释代谢物的可能代谢途径。首先,选择NMR分析技术结合多变量统计分析的代谢组学方法研究肾虚症大鼠、正常大鼠和复方中药六味地黄汤(LWDHT)干预的肾虚模型大鼠(LWDHT大鼠)尿液成分谱的变化。使用氢化可的松诱导wistar大鼠建立肾虚模型,NMR分析对照组、模型组和LWDHT组大鼠的尿液,使用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)处理图谱数据,寻找标记物,并解释代谢产物的变化,相关代谢通路或代谢网络的变化。对模型组和空白组,LWDHT组三个组别进行模式识别,结果显示三组之间可以实现分类,模型组大鼠与对照组比较,显示肾虚证大鼠机体在高剂量的氢化可的松诱导下,迅速进入了一个“机能亢进”的状态,这种对于能量和免疫系统的“过消耗”最后导致大鼠进入“耗竭”状态,在这个过程中,相关代谢通路发生了显著变化,肌氨酸酐(creatinine,δ4.05,3.04)等的共振峰相对积分面积增高,而二甲胺( dimethylamine,δ2.718 ),天冬氨酸( asparaginic acid,δ2.831 )牛黄酸(taurine,δ3.44,3.28),马尿酸(hippurate,δ7.84,7.56,3.97)等的相对积分面积则明显下降,这预示着糖皮质激素可能引起了肾上腺皮质分泌功能的损害。模型大鼠尿液的肌氨酸酐含量的增加,提示着肾虚与肾功能异常是密切相关的。琥珀酸(succinate,δ2.41)是三羧酸循环能量代谢及糖酵解的中间产物,其含量的降低,通常是由于线粒体功能紊乱引起。实验中LWDHT组的聚类点群位置处于模型组和空白组之间,显示LWDHT出对肾虚证大鼠具有修复代谢的作用。同时也应用NMR方法分析了三个组别大鼠的血浆,结合主成分分析和偏最小二乘判别分析,三个组别可以聚类分类,对于引起三个不同的代谢模式下大鼠血浆分类的标记成分进行鉴别,并对其代谢作出可能的解释。结果显示模型组的大鼠的血浆中的酪氨酸(tyrosine,δ3.18,6.88)含量有所增加,这可能是由于氢化可的松诱导加速了儿茶酚胺类物质的生物合成。模型组大鼠血浆中的葡萄糖和乳糖水平有所上升,结合生糖氨基酸丙氨酸浓度的升高,表明氢化可的松干预后大鼠代谢发生变化,糖酵解,糖异生的过程加强。柠檬酸(citric acid,δ2.53,2.72),琥珀酸(succinate,δ2.41)是三羧酸循环能量代谢及糖酵解的中间产物,其含量的降低,通常是由于线粒体功能紊乱引起。其次应用LC-MSn分析技术结合多变量统计分析的代谢组学方法研究肾虚症大鼠、正常大鼠、LWDHT大鼠尿液的组成成分谱的变化。LC-MSn分析三个组别的尿液,使用化学计量学处理图谱数据。分别使用主成分分析(PCA),自组织映射网络(SOM),模糊聚类(Fussy classify)三种模式识别方法,三个组别可以实现分类。显示了不同的模式识别技术对于代谢组学的后期数据处理各自具有独特的优势。再次应用基于LC-TOF/MS分析技术结合多变量统计分析的代谢组学方法研究肾虚症大鼠、正常大鼠、LWDHT干预大鼠尿液成分谱的变化,LC-TOF/MS分析对照组,模型组和LWDHT干预组大鼠的尿液,结合PCA和PLS-DA模式识别,寻找标记物,并解释标记物归属及代谢通路或代谢网络的变化。结果显示,三个组别可以实现分类,寻找到4个可能的代谢产物,分别为色氨酸,马尿酸,芥子醇,N1-Methyl-2-pyridone-5- carboxamide,其中色氨酸,马尿酸的量增加,可以推测是儿茶酚胺的代谢途径发生上调,马尿酸的增加说明苯丙氨酸的代谢发生异常。同时应用LC-TOF/MS分析技术分析了三组大鼠的血浆,寻找到两个脂类的标记物,且两者都呈现量的增加,显示在氢化可的松干预后,大鼠的脂类合成加快,在血浆中蓄积了更多的脂类,这与氢化可的松可以促进脂类的合成报道是一致的。最后应用GC-MS分析技术结合PCA和PLS-DA的代谢组学方法研究肾虚症大鼠、正常大鼠、LWDHT干预大鼠尿液的成分谱的变化。GC-MS分析对照组,模型组,LWDHT干预组大鼠的尿液,使用PCA和PLS-DA模式识别,三组之间可以实现分类,并且模型组大鼠在高剂量的氢化可的松诱导后代谢模式迅速发生变化,有正常代谢模式进入了一个“机能亢进”的状态,至造模结束,这种对于能量和免疫系统的“过消耗”最后导致了大鼠进入“耗竭”状态,在这个过程中相关代谢通路发生显著变化,由于氢化可的松的干预,酪氨酸的含量增加,显示可能是儿茶酚胺的生化合成途径发生蓄积,一些游离脂肪酸的含量增加,这与糖皮质激素促进脂类的合成是一致的。尿核苷代谢的水平的提高,推测是由于uridine diphosphate-GT的活性增加引起的,这是由于氢化可的松诱导的肝脏GT表达的结果。总之通过不同的分析技术分析空白大鼠、肾虚证大鼠和LWDHT干预的大鼠的尿样和血浆的分析结果显示,对于复杂的生物体液,单一的分析技术只能给出部分的化学和生物信息,将多种分析技术结合进行生物体液的研究是必需的和可行的。肾虚证作为常见的中医证之一,本课题应用代谢组学的方法对其进行了研究,为深入的认识肾虚证及相关疾病提供帮助,LWDHT作为一个复杂的混合物系统,对肾虚大鼠代谢显示出一定修复作用,为复方中药六味地黄汤的药效评价研究提供了证据。