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类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性、自身炎症性和自身免疫性疾病,以分泌多种促炎性细胞因子、滑膜增生和慢性炎症为特征。成纤维细胞样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLSs)在类风湿关节炎的关节损伤和滑膜炎中扮演着重要的角色。PSTPIP2,脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸-磷酸酶相互作用蛋白2,之前的研究表明其与炎症和自身炎症性疾病密切相关。本研究主要探究PSTPIP2在体外对FLSs的作用和在大鼠体内对佐剂性关节炎的影响以及其可能的机制。我们首先建立佐剂性关节炎(Adjuvant-induced arthritis,AIA)模型,然后通过一系列实验来探究PSTPIP2在成纤维细胞样滑膜细胞和佐剂性关节炎中的作用及其可能的机制。主要的研究内容概括如下:(1)PSTPIP2在FLSs中的表达在第0天向SD大鼠左后足爪注射0.1ml完全弗氏佐剂(Complete Freund’s adjuvant,CFA),在第24天处死大鼠,收集相关组织标本用于后续实验。通过WB和RT-qPCR分别检测PSTPIP2在滑膜组织和FLSs中的表达情况,其次采用免疫组化进一步检测PSTPIP在滑膜组织中的表达位置。结果表明,PSTPIP2在正常的滑膜组织和FLSs中高表达,在佐剂性关节炎的滑膜组织和FLSs中表达显著降低。(2)PSTPIP2抑制FLSs的炎症反应首先通过构建PSTPIP2过表达质粒,我们成功地在FLSs中过表达PSTPIP2。然后我们用RT-qPCR、WB和ELISA技术检测TNF-α、IL-6和IL-1β在FLSs中的表达。结果表明在FLSs中过表达PSTPIP2之后,TNF-α、IL-6和IL-1β的表达降低。这表明过表达PSTPIP2抑制FLSs的炎症反应。为了进一步阐明PSTPIP2与FLSs炎症反应的关系,我们在FLSs中沉默了PSTPIP2基因。结果表明在PSTPIP2沉默之后,TNF-α、IL-6和IL-1β的表达升高。这表明沉默PSTPIP2促进FLSs的炎症反应。以上结果表明,PSTPIP2抑制FLSs的炎症反应。(3)PSTPIP2抑制FLSs的增殖和上面的实验一样,我们分别在FLSs中过表达或沉默PSTPIP2,然后通过细胞增殖与示踪试验(CFDA SE assay)和WB实验检测了过表达或沉默PSTPIP2对FLSs增殖的影响。结果表明,过表达PSTPIP2抑制FLSs的增殖,沉默PSTPIP2促进FLSs的增殖。以上结果表明PSTPIP2抑制FLSs的增殖。(4)PSTPIP2与NF-kB通路之间关系的研究如上,在FLSs中过表达或沉默PSTPIP2之后,我们用WB检测了p-P65和p-IkB的表达。实验结果显示,过表达PSTPIP2后,p-P65和p-IkB的表达降低,而沉默PSTPIP2后,表达升高。(5)体内过表达PSTPIP2改善大鼠AIA的严重程度我们构建了过表达PSTPIP2腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)。先建立AIA模型(第0天,day 0),然后向大鼠膝关节腔注射(第8天,day 8)构建好的腺相关病毒,用来在体过表达PSTPIP2。实验分组为Normal、Model、AAV-empty和AAV-PSTPIP2。在第18天(day 18,此时AIA的症状达到峰值)处死大鼠,收集相关标本用于后续实验。分别于造模的不同时间点测量并记录大鼠体重、足肿胀和关节炎指数。WB实验结果表明从关节腔打入AAV后,大鼠的滑膜组织内PSTPIP2的表达明显升高,这提示体内过表达PSTPIP2成功。免疫组化实验表明PSTPIP2在正常FLSs中高表达,在AIA的FLSs中表达降低,在注射病毒的FLSs中表达较AAV-empty组高。与AAV-empty组相比,大鼠的体重、足肿胀和关节炎指数在AAV-PSTPIP2组中均得到了改善。以上结果表明,PSTPIP2在体内FLSs中的过表达改善大鼠AIA的严重程度。(6)在体过表达PSTPIP2改善AIA的形态学特征在第18天处死大鼠后,大鼠的右后足爪(非注射一侧的腿)用来进行HE染色、番红固绿染色和甲苯胺蓝染色。实验结果显示,体内过表达PSTPIP2能够改善AIA的关节形态学特征。(7)在体过表达PSTPIP2减少大鼠骨破坏如上,大鼠的右后足爪用来进行X-ray和micro-CT分析。实验结果表明,体内过表达PSTPIP2减少了大鼠膝关节的骨破坏。(8)在体过表达PSTPIP2减少炎症因子的释放分别用ELISA和RT-qPCR检测大鼠的血清和滑膜组织中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-17的表达。结果表明,体内过表达PSTPIP2减少炎症因子的释放。(9)在体过表达PSTPIP2减少破骨细胞的数量和RANKL:OPG的比率为了进一步探究PSTPIP2在体过表达与AIA的关系,我们检测了大鼠膝关节中破骨细胞的数量和RANKL与OPG的表达。结果显示,在体过表达PSTPIP2能减少破骨细胞的数量并且降低RANKL:OPG的比率。