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研究背景
肾细胞癌简称肾癌，是最常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤之一。对转移性肾癌尚无标准治疗方案，目前常采用IFN-a或(和)IL-2，或抗VEGF的多靶点激酶抑制剂二线药物。但是上述药物都是作用于全身，无靶点特异性。因此，需要寻找一种特异性治疗方法成为抗肾癌治疗的迫切需要。
G250／MN／CAIX是从多种RCC细胞系中鉴别和克隆出一种广泛表达的肾细胞癌相关抗原。所有的肾透明细胞癌和大部分其它类型肾癌都表达G250抗原，88％的转移灶也有该抗原表达。其在调节细胞内外pH方面发挥重要的作用。可能促进肿瘤细胞增生和转移，在肾癌的演变过程中起重要的作用。
目的
1.构建针对G250的shRNA真核表达载体；
2.观察RNAi沉默G250基因表达后，肾癌Ketr-3细胞生长速度和体外侵袭力的变化，初步了解G250在肾癌中的生物学功能，为探索肾癌的发病机理提供一定的实验基础及理论依据。
方法
1.根据Genbank中G250基因的序列，合成shRNA序列，克隆至真核表达载体pSilencer 2.1-U6-neo中，构建G250 shRNA真核表达载体，并经PCR、限制性双酶切和部分DNA测序鉴定；
2.经阳离子脂质体介导将表达载体转染至人肾癌Ketr-3细胞株中，经G418(400μg／ml)筛选后获得阳性转染细胞株，命名为Ketr-3-MNRi。RT-PCR在RNA水平和Westem blot、间接免疫荧光在蛋白水平分别对干扰效率进行检测；
3.MTT法绘制细胞生长曲线，观察干扰后细胞生长情况的变化；Transwell侵袭小室通过过膜细胞数的差异，探讨干扰因素对Ketr-3细胞的体外侵袭能力的影响。
结果
1.经PCR、限制性双酶切和部分DNA测序证实成功构建了G250 shRNA的真核表达载体，经阳离子脂质体介导转染Ketr-3细胞中，并经G418筛选后获得阳性克隆细胞株。
2.RT-PCR结果显示Ketr-3-MNRi组对mRNA抑制下降64.4％。，Western blot结果显示Ketr-3-MNRi的蛋白表达比Ketr-3-NC下降58.5％；间接免疫荧光显示Ketr-3／MNRi细胞的绿色荧光比Kerr-3、Ketr-3／NC弱很多。
3.细胞生长曲线结果显示Ketr-3-NC组细胞与未转染Ketr-3细胞两组间差异无统计学意义(p>0.05)。Ketr-3-MNRi组的肿瘤细胞生长与Ketr-3细胞，Ketr-3-NC组细胞相比较减慢(p<0.05)。
4.细胞体外侵袭力结果显示：Ketr-3-MNRi细胞其穿膜细胞数明显低于阴性对照组Ketr-3-NC及Ketr-3细胞组，差异有统计学意义(p<0.05)。但Ketr-3-NC及Ketr-3细胞组间差异无统计学意义(p>0.05)。
结论
1.成功构建了G250 shRNA的真核表达质粒，并经证实对肾癌Ketr-3细胞中的G250表达具有干扰效应;
2.抑制G250表达得Ketr-3细胞生长速度及侵袭力明显减弱，进而提示G250在肾癌发展中可能起重要影响作用，为探讨肾癌的发病机制提供新的线索。