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我国生态环境受到重金属镉(Cd)污染,主要通过水源、植物、动物等途径进入食物链从而在人体和动物体内蓄积,对人和动物机体多个系统和器官产生毒害作用,其中有近50%Cd蓄积在肾近端小管。海藻糖(Tre)是新发现的自噬促进剂,在拮抗重金属Cd方面的作用机制尚未阐明。因此,本课题选用Tre作为保护剂,从细胞凋亡、细胞自噬和氧化应激三个角度来探讨其对Cd所致大鼠肾小管上皮细胞的保护效应。首先,原代培养大鼠肾小管上皮细胞(rPT cell)进行Cd和Tre共处理。通过CCK-8法检测细胞存活率和相差显微镜观察细胞形态学进行Tre保护浓度的筛选,发现5mM Tre能够缓解Cd致的细胞死亡。接着通过流式细胞术检测细胞凋亡率和激光共聚焦观察细胞凋亡形态学变化,结合蛋白免疫印迹技术检测凋亡关键蛋白(cleaved-PARP、cleaved-caspase 9和cleaved-caspase 3)表达水平,发现Tre保护组能下调细胞凋亡率和凋亡关键蛋白表达水平。结果表明,Tre能够抑制Cd导致细胞凋亡激活,减少细胞死亡。其次,探究Tre对Cd致细胞自噬抑制的影响。通过分析LC3和SQSTM1/p62蛋白表达水平变化,结合RFP-GFP-LC3和GFP-LC3转染结果,发现Tre能够明显缓解Cd导致自噬流抑制和减少自噬小体的累积。接下来采用激光共聚焦显微镜观察自噬体-溶酶体融合情况(LAMP-1和LC3共定位),发现Tre能够缓解Cd暴露导致的自噬体-溶酶体融合受阻。此外检测了溶酶体酸碱度和溶酶体降解能力,结果表明,Tre可以缓解Cd导致的溶酶体功能损伤,从而恢复溶酶体功能。最后,探讨Tre对Cd致氧化应激的影响。检测细胞内活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量,结果表明Tre能够缓解Cd致大鼠肾小管上皮细胞的氧化损伤。由于Nrf2-Keap-1通路是细胞内重要的氧化应激防御机制,我们进一步探讨Tre对Cd致氧化损伤的缓解是否与之相关。通过检测Nrf2-Keap-1相关通路中抗氧化蛋白,发现Cd能够激活Nrf2入核且Nrf2下游相关抗氧化蛋白[醌氧化还原酶1(NQ-O1)、血红素加氧酶-1(HO-1),谷胱甘肽合成相关蛋白(GCLC、GCLM和GR)和相关解毒酶(SOD、CAT和GPx)]表达水平均上调,然而添加Tre后能够抑制Nrf2激活,下调相关抗氧化蛋白表达水平。结果表明,Tre能够抑制Cd导致的自身抗氧化系统Nrf2-Keap-1通路的激活,通过自身的抗氧化作用缓解Cd暴露所致的氧化损伤。综上所述,Tre是新型的自噬促进剂,在Cd致细胞死亡的保护中发挥重要作用。Tre能够缓解Cd致细胞凋亡主要通过抑制线粒体凋亡途径的激活。Tre可缓解自噬流,促进自噬体-溶酶体融合和缓解溶酶体损伤,从而缓解Cd致自噬抑制。此外Tre作为抗氧化剂能够缓解Cd致氧化应激损伤主要是通过抑制Cd激活Nrf2-Keap1信号通路。总之,本研究将从细胞凋亡、细胞自噬和氧化应激三个方面阐明Tre的保护效应,为Tre缓解Cd中毒提供了扎实的理论依据。