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目的:研究壁虎粗多肽(GCPs)对人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞增殖、迁移、凋亡能力的影响及其分子机制;探讨Vitamin C与GCPs联合使用对SHSY5Y细胞的作用研究;初步研究部分多肽单体对SH-SY5Y细胞的作用。方法:GCPs对SH-SY5Y细胞增殖、迁移、凋亡能力的影响及其机制:用不同浓度GCPs(0,0.08,0.12,0.16,0.20,0.24,0.32 mg/m L)分别处理SH-SY5Y细胞24h,48h,72h,噻唑蓝比色法(MTT)检测SH-SY5Y细胞增殖能力变化。SHSY5Y细胞分为正常组,低、中、高(GCPs:0.1,0.16,0.24 mg/m L)组。GCPs作用于SH-SY5Y细胞后,划痕实验观察细胞迁移能力的变化;Transwell迁移实验检测GCPs对SH-SY5Y细胞迁移能力的影响;Hoechst 33258荧光染色检测GCPs对SH-SY5Y细胞核形态影响;流式细胞术检测细胞凋亡情况。免疫印迹法检测GCPs对SH-SY5Y细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)蛋白表达的影响;检测GCP作用SH-SY5Y细胞后,细胞PEPCK酶活力;验证PEPCK过表达是否会影响SH-SY5Y细胞增殖:将过表达的PEPCK质粒转染到SH-SY5Y细胞,观察细胞的生长状态、Hoechst 33258荧光染色检测细胞核变化、划痕实验检测细胞划痕愈合能力。GCPs与Vitamin C联用对SH-SY5Y细胞增殖、迁移、凋亡能力的影响:取对数生长期的SH-SY5Y细胞,GCPs浓度每组终浓度均为0.15 mg/m L,且将每组Vitamin C的终浓度分别调到(0,0.005,0.01,0.05,0.10,0.15,0.2,0.25,0.3mmol/L)。置于37℃培养箱继续培养,24 h、48 h、72 h后,用MTT法细胞增殖率。划痕实验观察细胞迁移能力的变化。SH-SY5Y细胞分为4组:对照组GCPs(0.1 mg/m L)组,Vitamin C(0.1 mmol/m L)组,GCPs(0.1 mg/m L)+Vitamin C(0.1 mmol/m L)组;Hoechst 33258荧光染色检测细胞核形态变化;流式细胞术检测细胞的凋亡率变化。MTT法检测合成肽对SH-SY5Y细胞的活性。结果:不同浓度GCPs分别处理SH-SY5Y细胞24 h,48 h,72 h后,MTT检测IC50值分别0.24 mg/m L,0.21 mg/m L,0.18mg/m L;与空白对照组相比,GCPs低、中、高剂量均可显著抑制SH-SY5Y细胞愈合能力,P<0.01。与对照组相比,GCPs能够显著抑制SH-SY5Y细胞穿过滤膜的能力,且作用浓度越高,抑制作用越明显;在荧光显微镜下观察,空白对照组的蓝色荧光均匀,圆形,形态较好。而GCPs处理组蓝色荧光分布不均,细胞核缩小,呈不规则状,有较强荧光团出现,且随GCPs浓度增加,凋亡形态更加明显。流式细胞术检测SH-SY5Y细胞凋亡率,与空白对照组相比,GCPs剂量组细胞凋亡率增加,且与浓度呈正相关,P<0.05。GCPs处理后的SH-SY5Y细胞内caspase-3和caspase-9蛋白表达上调。说明GCPs对SH-SY5Y细胞凋亡有一定的诱导作用。GCPs作用SH-SY5Y细胞后,细胞PEPCK酶活力增高;当过表达的PEPCK质粒转染到SH-SY5Y细胞后,细胞凋亡率增加,划痕愈合能力减弱。Vitamin C在24 h,48 h的半数抑制浓度IC50值分别为0.1242 mmol/L,0.1213 mmol/L。与对照组(GCPs 0.15 mg/m L)比较,Vitamin C能够增强GCPs抑制SH-SY5Y细胞增殖的作用,并随时间和Vitamin C浓度的增加,增殖抑制作用更加显著。空白组SH-SY5Y细胞贴壁生长,大小均一,细胞突起较长,轮廓清晰完整,生长状态较好,胞质均匀。GCPs(0.1 mg/m L)组细胞胞体轻微肿胀,有生长聚集现象出现,细胞边界较清晰。Vitamin C(1 mmol/m L)组细胞,胞体轻微肿胀,突起有所缩短。GCPs(0.1 mg/m L)+Vitamin C(1 mmol/m L)组细胞胞体肿胀严重,突起明显缩短,细胞变圆、变亮,有细胞碎片出现。GCPs(0.1mg/m L)组、Vitamin C(0.1 mmol/m L)组细胞与空白对照组细胞相比,划痕愈合能力减弱,但均无明显差异(P>0.05)。GCPs(0.1 mg/m L)+Vitamin C(0.11mmol/m L)组细胞与空白对照组细胞相比,划痕愈合能力显著降低(P<0.05)。Hoechst 33258荧光染色后荧光显微镜下观察,空白对照组细胞核荧光大小较均一,分布均匀,圆形,形态较好。而GCPs(0.1 mg/m L)处理组细胞细胞核蓝色荧光分布相对均匀,细胞核荧光与空白对照组相比基本无差别。Vitamin C(1mmol/m L)组处理过的细胞与空白对照组相比核略有皱缩。GCPs(0.1 mg/m L)+Vitamin C(1 mmol/m L)组细胞荧光强度增加,核明显皱缩,荧光分布不均,有强荧光团出现。多肽单体对SH-SY5Y细胞作用24 h时:有7种多肽单体当浓度达到0.1mg/m L时对SH-SY5Y细胞具有促增殖作用。在一定浓度范围随作用浓度的升高,增殖率增加。有2种多肽单体呈现出弱抑制增殖趋势;多肽单体对SHSY5Y细胞作用48 h时:只有2种多肽单体(GPSA,EDTE)对SH-SY5Y细胞有促增殖作用。其它7种为抑制增殖作用,其中单体STPS和单体EQLQ抑制作用比较显著。同一种壁虎单体作用时间不同,对SH-SY5Y细胞有不同的活性。结论:GCPs可以抑制SH-SY5Y细胞增殖、迁移,诱导其凋亡;GCPs诱导SH-SY5Y细胞凋亡的机制可能与caspase凋亡途径和PEPCK基因和其酶活性相关;PEPCK基因过表达时可以抑制SH-SY5Y细胞增殖、迁移,诱导其凋亡,可能与caspase-3相关的凋亡途径和能量代谢相关;适量浓度范围内Vitamin C注射液可以增强GCPs抑制SH-SY5Y细胞增殖、迁移,诱导其凋亡的作用;9种壁虎多肽单体对SH-SY5Y细胞增殖作用不同,同一种多肽单体作用时间不同对细胞的增殖影响也不同。