人Ap4A水解酶的结构生物学研究和嗜肺军团菌RpoS克隆、表达、纯化及初步晶体学研究

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1.人Ap4A水解酶的结构生物学研究  二腺苷四磷酸(Ap4A)存在于从古细菌到人类的所有活细胞中,并一直被认为是原核生物和真核生物的胞内警报分子。在细胞内,它影响DNA修复、RNA编程、细胞分化、热激和氧分压、凋亡和转录调控等生物过程。因此Ap4A的水平必须受到严格调控。  Ap4A水解酶(非对称性二腺苷四磷酸水解酶,EC3.6.1.17)负责水解Ap4A,因此参与上述所有的生物过程。最近的证据表明SARS-CoV7a蛋白与人源Ap4A水解酶相互作用,并可能共同参与导致细胞周期停滞和细胞凋亡的途径。Ap4A水解酶属于Nudix水解酶超家族,发挥活性依赖Mg2+,催化核苷二磷酸基团的水解,包含了保守的Nudix序列GX5EX7REUXEEXGU(U代表一个疏水氨基酸残基,通常是Ile、Leu或者Val,X代表任何残基),特点是从结合腺苷部分切开多磷酸盐链的第四位磷酸基团。根据系统发育分析,Ap4A化水解酶被分为动物-古细菌类型和植物-细菌类型两类。对两类Ap4A水解酶结构的研究发现这些酶均含有一个αβα-sandwich结构的Nudix折叠,但动物-古细菌类型和植物-细菌类型酶的底物结合位点存在重要的差异。  在这篇文章中,我们解析了人源Ap4A水解酶E58A突变体与底物分子的复合物晶体结构,这对于了解这类酶的底物结合模式可能具有重要的意义。  2.嗜肺军团菌RpoS的克隆、表达、纯化及初步晶体学研究  嗜肺军团菌(Legionella pneumophila,L.pneumophila)是一种革兰氏阴性菌,它侵染人肺泡组织后能引起致命性的肺炎(Legionnaires disease,军团病或嗜肺军团菌肺炎)。L.pneumophila在宿主细胞内的生活周期分为两个阶段:在人肺泡细胞中的大量增殖阶段(指数期)和对其他细胞的感染阶段(稳定期)。L.pneumophila在宿主胞内的增殖是一个有序的过程,需要感应大量的信号并对其做出反应,表明这个过程包含了一个复杂的调控网络。L.pneumophila的一组基因(dot/icm:defective for organelle trafficking/intracellular multiplication)编码的Dot/Icm分泌系统(简称Dot/Icm系统)与typeⅣ分泌系统同源,其组分几乎参与了L.pneumophila在宿主胞内寄生的所有方面,比如介导进入宿主细胞、胞内复制、LCV(Legionella-containing vacuole)的形成、抑制宿主细胞的凋亡等等。L.pneumophila在宿主细胞内增殖还受到另外两个“双组分系统”的调控:CpxRA(conjugation plasmid expression regulator/A)/PmrAB(polymyxin-resistant A/B)系统直接调控Dot/Icm系统的底物基因的转录,LetAS(Legionella transmissionactivator/sensor)系统则正调控影响指数后期嗜肺军团菌表型基因的表达。RpoS位于CpxRA/PmrAB和LetAS这两个“双组分系统”调控通路的上游,间接调控L.pneumophila在宿主细胞内的增殖。  研究表明嗜肺军团菌中的RpoS(L.pneumophila RNA polymerase sigmafactor,L.pneumophila RpoS)影响L.Pneumophila胞内增殖所需的多条通路的相关基因的表达。另外,L.pneumophila RpoS在同源蛋白与DNA结合的区域缺少一段插入序列,因而缺乏潜在的DNA结合抑制机制,可能存在一种新的机制在RNAP缺乏时抑制RpoS与DNA相互作用。因此研究L.pneumophila RpoS的晶体结构将有助于理解其参与L.Pneumophila胞内增殖的多条信号通路的机制及在RNAP缺乏时RpoS与DNA相互作用被抑制的机制。  在这部分内容中,我们描述了L.pneumophila RpoS的克隆、表达、纯化及初步晶体学研究。  
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