【摘 要】
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目的构建大鼠增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene,rHSG)的真核表达载体rHSG/pExpress-1并鉴定,为进一步构建腺病毒载体及恶性胶质瘤的基因治疗提供物质基础。方法
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目的构建大鼠增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene,rHSG)的真核表达载体rHSG/pExpress-1并鉴定,为进一步构建腺病毒载体及恶性胶质瘤的基因治疗提供物质基础。方法(1)总RNA的提取:利用大鼠心肌组织,TRIZOL法提取心肌细胞总RNA;(2) RT-PCR扩增目的基因:设计含有NotⅠ和SacⅡ酶切位点的一对引物(上游引物含NotⅠ酶切位点,下游引物含SacⅡ酶切位点)经过逆转录反应获得rHSG的CDS(Coding Sequence),再以cDNA的CDS序列为模板进行PCR扩增反应,然后回收、纯化、酶切;(3)重组DNA的体外构建及鉴定:将扩增的rHSG cDNA连接到质粒pExpress-1上,构建大鼠增殖抑制基因的真核表达载体rHSG/pExpress-1,并对重组表达质粒进行限制性内切酶酶切鉴定;(4)序列分析:将重组质粒送测序公司进行DNA序列分析。结果(1) TRIZOL法成功提取心肌细胞总RNA;(2) RT-PCR反应扩增后产生的rHSG基因片段经电泳分析证实在预期的位置上,表明目的基因克隆成功;(3)经酶切鉴定证实,成功地构建了真核表达载体rHSG/pExpress-1;(4)重组真核表达载体rHSG/pExpress-1经NotⅠ和SacⅡ双酶切后,进一步将重组体进行基因测序分析,验证了克隆的rHSG cDNA序列与GenBank[AF036536]公布的rHSG序列吻合。这一结果表明重组体rHSG/pExpress-1中插入的目的基因是正向、单倍插入。结论成功构建了大鼠增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene,rHSG)真核表达载体rHSG/pExpress-1,为深入研究rHSG功能和rHSG基因治疗恶性胶质瘤奠定了物质基础。
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