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胆固醇(cholesterol，Ch)代谢紊乱是胆系疾病形成的重要物质基础，既往研究证实Ch能改变胆囊动力，Ch结石患者的胆囊及高Ch饲养后动物胆囊收缩性下降，认为这是高Ch引起结石的原因。目前，Ch代谢紊乱对胆管及胆管括约肌(sphincter of bile duct，SBD)功能、结构的影响及其在疾病发生中的作用日益受到人们的重视，我们的研究发现：胆固醇脂质体(cholesterol liposome，CL)不仅影响兔SBD平滑肌细胞骨架的构形、数量，而且不同浓度的CL对细胞的增殖亦有明显作用。胆道系统除了SBD主要由平滑肌细胞构成之外，其它部位还存在着大量成纤维细胞(fibroblast，Fb)，这些Fb对Ch的反应性及其在胆管构形演变中的作用，未见报道。我们采用体外培养的胆管Fb研究Ch对其增殖和表型的影响及机理，探讨Pb的增殖及表型转化与胆管括约肌重塑的关系。 1 目的 (1)研究Ch对兔胆管Fb增殖的影响，并对其机制进行探讨。 (2)观察Ch对兔胆管在体及离体Fb表型的影响。 2 方法 (1)分离、纯化、培养兔胆管Fb，完全随机分为三组：对照组、中等浓度Ch组(0.6g/L)和高浓度Ch(1.2g/L)。 (2)以MTT法测定各组细胞的增殖情况。 (3)流式细胞仪(flow cytometer，FCM)测定各组细胞周期。 (4)采用免疫组化法定量分析各组细胞内增殖细胞核抗原(PCNA)的表达情况。 (5)制作实验性高Ch血症模型，纯种新西兰兔16只，完全随机分为两组：对照组(标准饲料)，实验组(标准饲料+Ch)，喂8 第四果医大学硕士学位论文 一 周。 “）取各组兔胆管制作电镜标本，进行观察。 （）分离、培养、鉴定正常兔胆管 Fb，完全随机分为三组［分组 同问）］，作用72h，制作电镜标本，进行观察三 倍）运用激光共聚焦显微镜（laser scanmng co恤cal microscopy， LSCop分析各组〔分组同口问细胞内细胞骨架及a－acin的表达 情况。 3结果 问）中等浓度 Chu．4心．sg／L）可以使培养的免胆管 Fb MtA叩＿ 值显著升高，Ch（0．4g／L）A490nm值为 0．42D0．015，较对照组增加 ＊力％（P＜0＊5）；m（0＊叭）抑。＊值达到最大为0．46即对19，较 对照组增力95．2％（P＜0．of）；0．sg／LCh组A49咖值为0．47210刀17 较对照组增力 89．6％（P＜0刀1）；高浓度 Ch（1．Zg／L）明显抑本细 胞生长，＊M。nm值为0二63土0＊18，较对照组下降34．5％（P＜0＊5）。 Q）FCM分析显示，与正常组相比，中等浓度 Ch门．6叭）显 著增加 GZM期细胞比例，从 9．8％上升为 I3刀％，S期细胞比例从 11．7％上升为33．4％，而显著减少进入GO／GI期的细胞比例，从 78．5％下降为 53．6％。高浓度 Ch O．Zgh）显著减少 GZM期细胞 比例，从 9．8O降低为 6．7％，S期细胞比例从 11．7％下降为 5．9％， 而显著增加进入GO／GI期的细胞比例，从78．5％上升为87．4％， 使更多的胆管Fb处于相对静止期。 （3）PCNA免疫组织化学实验表明，对照组胆管Fb的PCNA染 色，核内无明显的阳性反应颗粒，染色强度为 88．3hil石％AU； 0石g／LCh组胆管Fb的PCNA染色强阳性，染色强度为126．3flo．2％ AUu功．05，vs对照组），可见胞核内呈现棕褐色颗粒；1．Zgh Ch — —4—— 第四军医大学硕士学位论文一可使胆管 Fb核内棕褐色颗粒显著减少，染色强度为 96．3＊11．4％AU u动刀5，vs中浓度 Ch组卜 （4）透射电镜下正常组胆管Fb呈梭形，胞浆内有丰富的粗面内质网Oough endoplasmic reticulm，RER），线粒体和微丝的含量较少，无基膜存在，呈典型的Fb的表型。高Ch喂养的兔胆管FbRER明显减少，胞浆内出现大量的微丝，以质膜下分布最多，成束的微丝交错处有密体形成，细胞质膜处有密斑和不连续的基膜形成，呈现平滑肌样细胞表型。 u）体外培养的免胆管Fb亦呈典型的Fb的表型，经中等浓度Chm．6g／L）刺激 72 h后。胆管 Fb内出现大量的微丝，但未见密体、密斑及不连续的基膜形成。 “）LSCM显示，0．6g／L Ch组细胞内出现大量规则排列的成束的微丝。a－actin表达量明显增多，平均荧光值为1628．32t189．24 （P动刀1Js对照组卜 1．Zg／L Ch组胆管 Fb内微丝显著减少，a｛ctin表达量减少，平均荧光值为 1427．281153．36（P功力5／S中浓度Ch组卜 对照组胆管Fb 内无明显的微丝，平均荧光值为1215．28土116．48。4结论 O）中等浓度Ch促进兔胆管Fb增殖，其机制可能与细胞内PCNA的表达有关Q）Ch可使兔胆管Fb出现平滑肌细胞的表型特点，体内环境下该变化更明显，说明此过程有体内其它因子参与，其机制尚待进一步研究。