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目的:丙酮酸是三大营养物质相互转换的枢纽，NADPH是维持细胞内还原性谷胱甘肽和体内许多生化反应的辅酶。肿瘤细胞通过提高谷氨酰胺的代谢来满足快速增殖和生存对NADPH和丙酮酸的需求。在此过程中，NAD(P)+-依赖的苹果酸酶2(ME2)将苹果酸转化成NAD(P)H和丙酮酸，是谷氨酰胺的代谢中关键酶，被认为是一个潜在的抗肿瘤新靶点。目前人源的ME2小分子抑制剂未见报道，因此，建立ME2小分子抑制剂的高通量筛选平台，寻找ME2的小分子抑制剂为研发新型抗肿瘤的药物奠定基础。 方法:我们利用大肠杆菌表达系统，表达纯化重组的人源ME2-His融合蛋白。酶标仪监测ME2产物NADH在340nm处的特征光吸收强度的变化，计算反应初速度，测定ME2的活性。通过优化ME2测活体系中的pH值、缓冲溶液、底物浓度、ME2浓度、DMSO浓度建立ME2小分子抑制剂的高通量筛选体系。用Z因子、性噪比评价高通量筛选体系。对国家新药筛选中心化合物库中化学合成的小分子化合物、网络药物发现平台天然产物（含中药有效成分）和天然产物的结构类似物进行筛选，寻找对ME2有抑制作用的化合物。通过优化ME2的浓度和染料浓度，建立验证化合物与ME2特异性结合的热位移分析体系。通过热位移分析方法和向筛选体系中加入表面活性剂（如Brij-35）验证对ME2有抑制作用化合物的特异性。MTS法检测ME2小分子抑制剂对肿瘤细胞增殖的影响。分析ME2小分子抑制剂与ME2之间的构效关系。通过研究ME2小分子抑制剂对酶动力学的影响，确定抑制剂的抑制类型。 结果:我们在体外表达纯化得到纯度较高的人源ME2-His融合蛋白。建立了Z因子为0.775，性噪比为9.83的ME2小分子抑制剂的高通量筛选体系。对国家新药筛选中心化合物库中的320，000个化学合成的小分子化合物和网络药物发现平台的12，683个天然产物（含中药有效成分）进行筛选，获得了105个对ME2有抑制作用的化合物。通过热位移分析方法和向筛选体系中加入表面活性剂验证活性化合物的特异性，获得了28个ME2小分子抑制剂，其中12个来源于天然产物。12个天然产物来源的ME2小分子抑制剂中有4个化合物对肿瘤细胞增殖有抑制作用，其中CAS0006-E009对A549、MCF7、K562、HL-60、HCT-15、8226的IC50分别为34.13μmol/L,38.08μmol/L,49.11μmol/L、18.97μmol/L,74.94μmol/L，19.9μmol/L。对CAS0006-E009进行结构改造，获得了16个结构类似物。16个结构类似物中有5个化合物对ME2的IC50小于20μmol/L。5个结构类似物中只有1个化合物——NPD389对A549、HCT-116的增殖均有较好的抑制作用，其在处理细胞72小时后的IC50分别为31.45μmol/L、11.55μmol/L，而且NPD389能时间依赖性地抑制HCT-116的增殖。得出了ME2小分子抑制剂与ME2之间的构效关系。分子水平的作用机制研究表明NPD389为快结合抑制剂，其抑制类型为混合型中的非竞争-竞争性抑制剂。 结论:建立了ME2小分子抑制剂的高通量筛选体系，为ME2小分子抑制剂的发现奠定了基础。建立了化合物与ME2结合的热位移分析体系，验证了ME2小分子抑制剂的特异性。ME2特异性的小分子抑制剂NPD389的发现，为研发抗肿瘤的新药提供了思路。