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小麦是世界上重要的粮食作物之一,其产量的提高对解决当今日益严重的粮食短缺问题起着至关重要的作用。细胞色素P450是植物中最大的蛋白家族之一,其中CYP78A是其重要成员之一,许多CYP78A亚家族成员已被鉴定出在种子生长发育过程中起着调节作用。本课题组通过同源克隆的方法分离得到TaCYP78A3和TaCYP78A5,并通过拟南芥的过表达和小麦BSMV-VIGS(大麦条斑花叶病毒诱导的基因沉默)证实其与籽粒大小有关。为进一步研究TaCYP78A5基因的功能,本研究开展了以下研究:(1)TaCYP78A5的原核表达和蛋白纯化利用生物信息学预测分析了TaCYP78A5氨基酸序列的结构及基本理化性质,分析结果显示该蛋白无信号肽,具有一个跨膜结构,是亲水蛋白。TaCYP78A5蛋白分子量为55.805 kD,理论pI值是8.32,共含有510个氨基酸,属于不稳定蛋白。去掉跨膜结构的截短体TaCYP78A5蛋白和截短体融合蛋白GST-TaCYP78A5的蛋白分子量分别为51.973 kD和80.385 kD,理论pI值分别为8.71和7.00。以植物表达载体pCAMBIA3301-TaCYP78A5为模板扩增得到不含N端跨膜结构的TaCYP78A5基因,连接原核表达载体pGEX-6-p-1构建了重组质粒pGEX-6p1-A5,转入表达菌株E.coli BL21(DE3)pLysS进行诱导表达。GST-TaCYP78A5融合蛋白以包涵体的形式表达,对包涵体蛋白经过洗涤、复性后用Prescission Protease酶切去除GST标签,切胶纯化回收得到高纯度目的蛋白,然而免疫兔子后未能得到抗体。(2)TaCYP78A5遗传转化及转基因小麦后代鉴定分析利用含植物表达载体pCAMBIA3301-35S-TaCYP78A5的农杆菌EHA105转化小麦绵阳19愈伤组织,经PPT筛选和PCR鉴定,获得1株阳性植株,移栽温室后未能存活。以济南邦迪生物科技有限公司提供的pINO::TaCYP78A5基因过表达的T0代转基因小麦为材料,对其进行Bar试纸条检测、PCR鉴定和外源目标基因拷贝数检测,并对转基因植株筛选最适Basta涂抹浓度进行了摸索;同时还对T1代株系中外源目标基因的分离比及阳性株系籽粒大小变化进行了统计。结果显示,21株T0代再生苗中共有14株阳性植株,其中有6株为单拷贝,5株为2个拷贝,2株为3个拷贝,1株为7个拷贝;6个单拷贝株系外源基因遗传分离比结果显示只有有3个株系符合3:1的分离比;Basta叶片涂抹结果显示,浓度200 mg/L的Basta溶液可有效地筛选出含Bar基因的阳性转基因植株;与野生型相比,7个T1代阳性植株的种子在粒宽、粒厚均有不同程度的增加,有2个植株粒长有所减小,但所有植株粒重均极显著增加,达到10~17%。