论文部分内容阅读
目的:急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是造血系统的髓系幼稚细胞恶性增殖而产生异常造血的一种克隆性疾病。骨髓(bone marrow,BM)微环境内存在着一群数量极少但具有自我更新能力的白血病干细胞(leukemia stem cell,LSC),能够启动并保持AML的恶性克隆,大多数LSC处于G0期,可免受针对细胞周期的传统化疗方案的杀伤而成为AML患者复发的根源。研究已知CD44抗体通过干扰AML-LSC与骨髓微环境间的作用而清除LSC,正常造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)则可‘逃逸’CD44抗体的作用。我们前期的体外实验结果显示CD44抗体(A3D8)可抑制LSC与BM基质细胞(stromal cells,SC)/成骨细胞(osteoblast,OB)间的粘附,且以后者为著,而对正常HSC与SC/OB无影响;划痕及CCK-8实验分别证实CD44抗体降低了OB的体外迁移和增殖能力,因此推测CD44抗体可能对骨髓微环境具有破坏作用。故本研究目的在于证实正常HSC和LSC对相同CD44抗体具有不同的反应性,旨在探讨CD44抗体靶向清除LSC的具体作用机制,为AML的临床治疗提供有利的理论依据。方法:培养人巨核细胞白血病细胞系M07e、从AML患者骨髓中提取分选CD34+CD38-细胞(AML CD34+CD38-),均用以替代LSC;从新生足月胎儿脐带血中提取分选CD34+细胞(CB CD34+)、培养人正常成骨细胞系hFOB1.19,分别替代骨髓微环境中的正常HSC和OB。本课题利用划痕加两种细胞分别接触共培养和Transwell非接触共培养实验,观察与HSC/LSC分别共培养时A3D8对OB迁移功能的影响。Wnt/β-catenin信号途径在干细胞生存、自我更新的维持中发挥着重要作用,为此免疫组化定性检测HSC/LSC和OB细胞内β-catenin的表达情况;利用Western blot定量检测A3D8作用下,HSC/LSC及OB细胞内β-catenin的蛋白表达量,以及与HSC/LSC共培养时OB中β-catenin的表达变化;通过细胞免疫荧光(IF)的方法观察A3D8对OB内β-catenin细胞核定位的影响作用。结果:1.与CB CD34+细胞共培养24h后hFOB1.19受A3D8(5μg/ml)抑制的迁移能力得以修复,随着时间的推移,hFOB1.19细胞逐渐向划痕间隙迁移,宽度明显减小;但是Transwell非接触共培养后,hFOB1.19细胞向划痕间隙迁移不明显,提示这种修复是通过两种细胞直接接触来完成的;相反,M07e/AML CD34+CD38-细胞却不具备这种修复功能。2.hFOB1.19中β-catenin表达呈阳性,阳性率高达100%,且其表达量明显高于M07e/AML CD34+CD38-细胞和CB CD34+细胞,二者分别呈阴性和极低表达。3.在5μg/ml药物浓度下,随着A3D8处理时间的延长(0h,24h,48h,72h),越来越明显地降低hFOB1.19中β-catenin蛋白的表达,且呈时间依赖性,β-catenin/GAPDH灰度比值分别为(98.52±6.04)%,(94.19±10.05)%,(79.86±13.96)%,(44.94±9.40)%,作用48h和72h后差异显著(P<0.05);但A3D8对CB CD34+和M07e细胞内β-catenin的表达均无影响。4.在5μg/ml药物浓度下,细胞接触共培养48h后hFOB1.19细胞内β-catenin蛋白表达(β-catenin/GAPDH灰度比值)分别为:OB组(92.40±12.74)%,OB+A3D8组(77.21±9.97)%,OB+CB CD34++A3D8组(92.75±10.79)%,OB+M07e/AML CD34+CD38-+A3D8组(69.31±9.11)%,与CB CD34+细胞接触共培养后hFOB1.19受A3D8抑制的β-catenin蛋白表达量逆转回升(P<0.05);而M07e/AML CD34+CD38-细胞却不具备这种修复能力。5.在5μg/ml药物浓度下,随着A3D8处理时间的延长(0h,24h,48h,72h),其逐渐降低了hFOB1.19中β-catenin细胞核定位,且具有时间依赖性,于48h之后作用较为明显。结论:1.CD44抗体可通过干扰骨髓微环境中OB的功能特异性杀伤LSC,但正常HSC则可修复OB受损伤的功能,而不受CD44抗体的影响。2.CD44抗体可通过下调OB细胞内β-catenin的表达及其核定位来影响OB的迁移及增殖等功能,进而特异性破坏LSC与其BM微环境的相互作用。3.CD44抗体可干扰Wnt/β-catenin信号通路靶向清除LSC,同时正常HSC通过修复作用实现自我保护而免受损害。