大肠杆菌可引起人和动物的肠内肠外各种疾病,给畜牧养殖造成重大经济损失并严重威胁公共卫生安全。目前,对抗细菌病原主要依靠抗生素和宿主自身免疫系统。抗生素通过干扰细菌必要的合成代谢发挥杀菌抑菌作用,而宿主则通过免疫细胞和免疫分子发挥抗细菌感染作用。正因为此,细菌进化出抵御外界不良环境的能力,除了环境选择使细菌获得药物降解、靶点突变或修饰的能力,细菌还会调控抗性蛋白、外排泵和胞内运输基因表达抵御抗生素损伤;而重要免疫因子过氧化氢刺激时,细菌上调表达过氧化氢酶、谷还原酶、超氧化物歧化酶等以对抗氧化压力,细菌的这一能力被称为“压力应激”。实现压力应激调控需要将胞外信号通过细胞膜上受体传递至胞内,改变RNA聚合酶和转录因子的活性调控相关基因表达以应对不良环境刺激。在细菌中,四(五)磷酸鸟苷酸pp Gpp(p)和多聚磷酸poly P是细菌应对不良环境的重要信号分子。pp Gpp(p)由三磷酸鸟嘌呤焦磷酸合成酶Rel A催化GTP焦磷酸化合成,该分子在氨基酸饥饿、碳营养缺乏、紫外线照射、氧化应激和渗透压等压力应激中均发挥重要作用。poly P由多聚磷酸激酶PPK以ATP和GTP为原料催化合成的高能磷酸多聚物,广泛存在于微生物细胞中,在细菌中发挥多种功能,缺失PPK会导致细菌毒力下降、存活能力和运动能力降低、群体感应和压力应激损伤。鉴于poly P在压力应激方面的重要作用,本研究构建了ppk缺失株Δppk,通过最小抑菌浓度测定、杀菌实验、基因表达检测(RNA-seq和q RT-PCR)、生物膜形成分析等方法研究PPK在肠外致病性大肠杆菌PCN033抗生素耐受中的作用;而poly P和pp Gpp(p)在过氧化氢耐受中均发挥基因调控作用,因此本研究在缺失株Δppk基础上构建了双基因缺株Δrel A-Δppk和Rel A缺失株Δrel A,通过最小抑菌浓度测定、抑菌实验、q RT-PCR、western blot等方法研究PPK在肠外致病性大肠杆菌PCN033中的相互调控关系,得到以下结果:1.浮游状态下,缺失株Δppk较野生株对抗生素敏感依据抗生素作用靶点,将本研究所选用的抗生素分为四类:破坏细菌细胞壁的β-内酰胺类和糖肽类、干扰蛋白质合成的氨基糖苷类和大环内酯类、干扰核酸合成的喹诺酮类和硝基呋喃类、破坏细胞膜的肽脂类。MIC分析显示,缺失株Δppk较野生株对抗生素敏感,尤其是对具有破坏细菌细胞壁功能的β-内酰胺类和干扰蛋白质合成的氨基糖苷类抗生素敏感。抗生素杀菌实验结果显示,浮游状态下,缺失株Δppk更容易被抗生素杀死。上述结果表明PPK参与抗生素耐受。2.RNA-seq和q RT-PCR检测缺失株Δppk的抗生素耐受相关基因的表达对未经抗生素处理的突变株Δppk和野生株WT进行RNA-seq和q RT-PCR验证分析,结果显示,16个抗性蛋白基因中仅tet B上调表达;参与抗生素外排的35个基因中下调表达的基因为mar A、mar B和mdt A;上调表达的基因为mdt G和madt E;参与抗生素胞内转运的基因中仅omp C上调。无抗生素处理时,参与抗生素耐受的相关基因基因表达在野生株和突变株中没有显著性变化。对突变株Δppk和WT进行他唑巴坦和庆大霉素处理,进行q RT-PCR验证。他唑巴坦处理会导致β-内酰胺类抗性蛋白基因bla(amp C)上调,同时上调的基因还有aac,arn A,nfs A;庆大霉素处理对抗性蛋白基因的表达没有影响,尽管突变株Δppk与WT之间外排基因均呈现上调趋势,但没有显著性差异。对随机筛选的外排泵基因进行q RT-PCR检测,结果显示,他唑巴坦和庆大霉素处理均会使acr A、acr D、cus C、emr A、mdt A和mar A显著性上调,但突变株Δppk的上调倍数低于WT。他唑巴坦处理对水孔蛋白基因表达基本没有影响,而庆大霉素处理则会导致内入基因omp C、omp F和pho E下调表达,但缺失株Δppk中下降的倍数显著低于WT。在抗生素处理条件下,参与抗生素耐受的相关基因表达在WT和Δppk中具有显著性差异,说明PPK参与抗生素压力应激是通过接受刺激信号后调控抗性蛋白、外排泵和胞内运输基因表达实现。3.q RT-PCR验证poly P对参与抗生素耐受的双组分系统(TCSs)的激活情况由于抗性蛋白基因bla(amp C),胞内运输基因omp C,omp F和外排泵基因acr A,acr F,acr D分别受到双组分调控系统Fim Z,Omp R和Pho B,Cpx R,Evg A和Tor R的调控。对参与抗生素耐受的双组分调控系统Fim Z,Evg A,Omp R,Pho B,Bae R,Cpx R,Tor R的下游基因amp C,emr KY,omp CF,pho A,tor ACD,mdt AB和deg P进行RNA-seq和q RT-PCR验证。未经抗生素时,与野生株相比,Fim Z调控的抗性蛋白基因amp C没有显著性变化;Bae R调控的mdt A显著性下调,其他双组分调控的下游基因没有显著性变化;而Omp R调控的omp C和omp F表达显著性上调。对WT和缺失株Δppk进行庆大霉素处理,同时将敏感性未发生改变的诺氟沙星作为对照,进行q RT-PCR验证。结果表明,诺氟沙星处理,与未处理野生株相比,仅有Fim Z下游基因amp C表达上调,而突变株Δppk内表达未有显著性变化。庆大霉素处理,与未处理野生株WT相比,Tor R,Bae R,Cpx R下游基因的表达均显著性上调,且显著性高于Δppk.过表达poly P合成酶基因ppk会导致Fim Z,Evg A,Pho B,Tor R,Bae R和Cpx R下游基因表达上调,而过表达poly P外切酶基因ppx则会导致这些双组分下游基因表达下调。结果表明,poly P参与双组分系统的激活与调控,并参与抗生素耐受。4.PPK参与生物膜形成且因而影响抗生素耐受刚果红染色实验表明,与生物膜形成相关的胞外多糖等物质合成减少,表明Δppk缺失株生物膜形成受损。抗生素未处理条件下,RNA-seq显示突变株Δppk中参与生物膜形成的鞭毛基因、菌毛基因表达下调;同时,他唑巴坦和庆大霉素处理条件下,尽管鞭毛和菌毛基因的表达趋势不变,但参与生物膜形成的调控因子ydd V、mcb R和bol A基因在WT中上调而突变株Δppk中下调,基因表达结果与缺失株Δppk生物膜形成受损的表型较为符合,说明PPK参与生物膜合成。MIC结果显示,Δppk突变株的生物膜细胞与WT的生物膜细胞具有相同的抗生素敏感性。同时,抗生素清除突变株Δppk和WT生物膜的效率几乎没有差异。最后,抗生素杀菌实验表明,他唑巴坦和庆大霉素对Δppk突变株和WT突变株的生物膜细胞具有相同的杀菌效果。这个结果说明,生物膜参与抗生素耐受,而PPK不影响细菌生物膜细胞状态下的抗生素耐受。5.PPK与Rel A均参与过氧化氢耐受且均影响细菌致病能力MIC分析和过氧化氢杀菌实验表明,缺失株Δppk、缺失株Δrel A和双缺失株Δppk-Δrel A相比于WT对过氧化氢的耐受程度下降。杀菌实验表明,PPK与Rel A协同参与过氧化氢耐受。尽管过氧化氢处理不会导致WT内poly P含量发生显著性变化,但是在PPK过表达的菌株中,过氧化氢处理会导致poly P含量显著性上升,poly P在此过程中发挥过氧化氢应激调控功能。对野生株、突变株Δrel A和Δppk进行倍比稀释,将107、106剂量的细菌进行昆明小鼠攻毒实验,缺失株Δppk和Δrel A的小鼠死亡数目下降、存活时间延长。细菌攻毒实验表明,PPK和Rel A参与细菌致病过程。6.PPK调控pp Gpp(p)合成酶基因rel A表达q RT-PCR表明,缺失株Δppk内rel A表达轻微下调,在PPK过表达的菌株中,rel A表达显著性上调;同时,Western Blot分析显示过表达PPK会导致Rel A蛋白表达显著上调。在PCN033中过表达大肠杆菌本身的PPX不会导致rel A下调,但过表达酿酒酵母超强活性的PPX则会导致rel A处于几乎不表达的状态。该结果表明,发挥rel A基因表达调控功能的应该为poly P分子而非PPK蛋白。说明PPK在rel A表达过程中发挥调控功能。7.rel A基因上游调控序列TCSs结合位点预测与TCSs蛋白表达过表达TCSs反应调控因子,进行荧光定量PCR验证,发现多对双组分系统参与调控rel A基因的表达。对rel A基因上游1000bp的序列进行预测分析,分别找出了双组分反应调控因子Pho B,Omp R,Cpx R,Dpi A,Bas R,Bae R,Tor R,Arc A可能的结合位点。构建Env Z-Omp R,Pho P-Pho B,Cpx A-Cpx R,Tor S-Tor R,Bae S-Bae R,Evg S-Evg A等12个蛋白,进行后续实验,以poly P为供体进行体外磷酸化TCSs蛋白,并进行凝胶阻滞实验,确定TCSs在rel A基因上游确定的结合位点。