【摘 要】
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目的研究阿司匹林对结肠癌细胞“保护性自噬”的作用及可能的机制。方法1.通过TIMER和Prognsan数据库分析自噬相关蛋白SQSTM1/p62在结肠癌中表达水平及其对生存期的影响;免疫组化分析SQSTM1/p62在结肠癌及癌旁组织中的表达,并探讨其表达水平与患者病理资料的相关性;2.CCK-8、平板克隆形成、划痕愈合实验检测阿司匹林对结肠癌细胞HCT-116、SW480增殖、集落形成和迁移能力影
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目的研究阿司匹林对结肠癌细胞“保护性自噬”的作用及可能的机制。方法1.通过TIMER和Prognsan数据库分析自噬相关蛋白SQSTM1/p62在结肠癌中表达水平及其对生存期的影响;免疫组化分析SQSTM1/p62在结肠癌及癌旁组织中的表达,并探讨其表达水平与患者病理资料的相关性;2.CCK-8、平板克隆形成、划痕愈合实验检测阿司匹林对结肠癌细胞HCT-116、SW480增殖、集落形成和迁移能力影响;利用Hank’s平衡盐溶液模拟体内营养缺乏微环境,基于此分为4组:正常对照组、Hank’s干预组、低剂量阿司匹林+Hank’s干预组、高剂量阿司匹林+Hank’s干预组,HE染色观察细胞形态变化、透射电镜观察细胞自噬、Western blot检测自噬及凋亡相关蛋白（p62、LC3、Bax、Bcl-2）的表达;慢病毒转染技术构建HCT-116、SW480自噬研究的细胞模型,荧光显微镜、流式细胞仪检测转染效率,激光共聚焦显微镜检测上述4组细胞内自噬流的变化;3.Western blot检测上述4组TRIM33蛋白的表达情况;利用脂质体法转染TRIM33-si RNA,Western blot检测敲降效率,在此基础上将实验分为3组:阴性对照组、si-TRIM33组、阿司匹林+si-TRIM33组,透射电镜用于观察自噬、Western blot检测TRIM33、p62、LC3蛋白表达的变化。结果1.TIMER数据库提示SQSTM1/p62在结肠癌中高表达（P＜0.05）;Prognsan数据库提示SQSTM1/p62表达水平越高,患者预后越好;免疫组化结果示SQSTM1/p62在结肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织（P＜0.05）,其表达水平与患者临床病理资料均无关（P＞0.05）;2.CCK-8结果显示,阿司匹林抑制结肠癌细胞的增殖,其中HCT-116在24h和48h的IC50分别为2.96、1.34mmol/L,SW480在24h和48h的IC50分别为1.74、1.37mmol/L,选取0.5mmol/L、1mmol/L进行下列实验;平板克隆形成、划痕愈合实验结果提示阿司匹林抑制结肠癌细胞的克隆形成及迁移能力（P＜0.05）,HE染色结果提示:与正常对照组相比,Hank’s干预组细胞形态变圆,细胞密度显著减少,在Hank’s干预组的基础上阿司匹林处理后,细胞核位置深染,胞质浓缩,细胞密度进一步减少;透射电镜结果表明,与HCT-116正常组细胞相比,Hank’s干预组胞质内可见大量自噬小体及自噬溶酶体,在Hank’s干预组的基础上给予阿司匹林后,胞质内自噬小体和自噬溶酶体显著减少,线粒体嵴断裂;Western blot结果显示:与正常对照组相比,Hank’s干预组p62蛋白表达水平下降,LC3II/ACTB、Bax/Bcl-2的表达上升（P＜0.05）,与Hank’s干预组相比,阿司匹林干预后p62、Bax/Bcl-2蛋白表达上升,LC3II/ACTB的表达下降（P＜0.05）;流式细胞仪和荧光显微镜结果显示:与对照组结肠癌细胞相比,转染组细胞荧光表达率约达90%以上,提示细胞系构建成功;激光共聚焦显微镜检测自噬流结果显示:与对照组细胞相比,Hank’s干预组细胞内红绿色荧光斑点数目明显增加,表明自噬被激活;与Hank’s干预组相比,阿司匹林干预后出现红绿色荧光均减弱,说明阿司匹林可以抑制Hank’s诱导的自噬流;3.Western blot检测TRIM33的表达显示:与正常对照组相比,Hank’s干预组TRIM33蛋白表达水平下降（P＜0.05）,与Hank’s干预组相比,阿司匹林干预后TRIM33蛋白表达水平上升（P＜0.05）;Westernblot检测si RNA干扰效率显示:相比于阴性对照组,si-TRIM33组TRIM33的表达均显著下降（P＜0.05）;透射电镜结果表明,与HCT-116阴性对照组相比,si-TRIM33组细胞质可见大量自噬小体及自噬溶酶体,阿司匹林+si-TRIM33组细胞质内自噬小体和自噬溶酶体较si-TRIM33组减少;Western blot检测结果提示:与阴性对照组相比,si-TRIM33组TRIM33、p62蛋白表达水平下降,LC3II/ACTB的表达水平上升（P＜0.05）,与si-TRIM33组相比,阿司匹林+si-TRIM33组TRIM33、p62蛋白表达水平上升,LC3II/ACTB的表达水平下降（P＜0.05）。结论1.SQSTM1/p62在结肠癌中高表达,其高表达与不良预后存在关系;2.阿司匹林能够抑制结肠癌细胞的增殖、克隆形成及迁移能力;并可以通过抑制结肠癌细胞内“保护性”自噬、诱导细胞凋亡;3.阿司匹林可能通过促进TRIM33的表达调控结肠癌细胞内自噬的水平从而发挥其抑癌作用。
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