补体系统是先天免疫系统的重要组成部分,由一系列与凝血酶原同源的丝氨酸蛋白酶组成。近年来,补体系统的作用已从以血液为基础的抗菌感染转向广泛的免疫调节和组织稳态调节。在肿瘤微环境（TME）中,除了参与先天免疫外,许多补体蛋白还可促进免疫细胞与肿瘤细胞之间的交互作用。补体C3是补体激活的核心成分,补体C3的激活导致C3a的产生,C3a是TME中显著的肿瘤促进因子。之前,我们课题组和其他研究者已证明了C3aR信号通过促进免疫抑制促进肿瘤生长。然而,C3a-C3aR信号通路在乳腺癌组织中的作用仍有待进一步研究。已发表的研究表明,C3a-C3aR信号参与了肺纤维化和肾纤维化的形成,其特点是成纤维细胞的活化,这揭示了C3a-C3aR轴通过调节TME中的成纤维细胞而促进转移的潜力。越来越多的证据表明,肿瘤转移往往不仅依赖于肿瘤细胞本身,而且还受TME的调节。癌相关成纤维细胞（CAFs）是TME中聚集的数量最多的肿瘤细胞（如乳腺癌、肝癌）,并通过多种途径促进肿瘤的转移。控制CAFs的功能是一种很有前途的癌症治疗策略。然而,C3a-C3aR信号是否以及如何参与到CAFs的调控中仍是一个很大的未知数。在本研究中,我们证实C3a通过调节CAFs促进肿瘤细胞转移。C3a与其同源受体C3aR结合,激活PI3K/AKT信号通路,导致CAFs活化。此外,在人类侵袭性乳腺癌中,C3表达与CAFs激活标记和功能效应因子的表达呈正相关。C3aR信号的遗传或药物逻辑阻断能有效抑制乳腺癌的肺转移。我们的数据表明,靶向C3aR可能是一种有效的肿瘤转移控制策略。方法:1.补体C3a/C3aR信号缺失对乳腺癌肺转移的影响。（1）在Balb/c（WT）和C3aR^-/-小鼠建立4T1乳腺癌原位接种肺转移模型;（2）接种肿瘤细胞后,每周对4T1肿瘤大小进行测量两次,并绘制两种小鼠肿瘤生长曲线;（3）原位接种28天后,麻醉并处死小鼠,取出肿瘤组织,比较两组小鼠肿瘤的重量;（4）取出肿瘤,经消化得到细胞悬液,经流式染色,比较两组小鼠肿瘤细胞Ki67的表达。（5）通过免疫荧光染色及WB检测WT与C3aR^-/-小鼠肿瘤细胞EMT化相关分子表达。（6）原位接种28天后,比较小鼠肺部转移灶数量。2.补体C3a/C3aR信号调控CAF的功能（1）将4T1细胞原位接种WT或C3aR^-/-小鼠。小鼠接种肿瘤16天后处死,收获肿瘤。RNA测序,WT和C3aR^-/-4T1肿瘤的基因本体富集分析。（2）接种后16天,用流式细胞术（FACs）从各组小鼠肿瘤组织中分离出CAF细胞,PDGFR⁺F4/80^-。（3）胶原酶消化肿瘤获得细胞悬液,流式细胞染色,比较两组间Ki67在PDGFR⁺F4/80^-细胞中的百分比。（4）体外培养的CAF细胞免疫荧光染色,检测CAF细胞表面C3aR的表达。（5）流式分选WT/C3aR^-/-小鼠肿瘤中的CAF细胞,分别为PDGFR⁺F4/80^-。比较相关功能分子的表达。（6）根据RNA-Seq数据库,分析人乳腺癌组织中C3表达与CAF细胞功能分子的相关性。（7）比较4T1肿瘤细胞与WT/C3aR^-/-CAF共培养后的迁移侵袭能力。（8）将WT或C3aR^-/-肿瘤CAF细胞分选,分别与4T1细胞按1:10的比例原位接种于裸鼠,4T1单独接种作为对照。监测肿瘤生长情况,绘制生长曲线。（9）接种28天后,取肿瘤,比较三组小鼠的肿瘤重量。观察小鼠肺转移灶,统计两组小鼠肺转移灶数量。3.补体C3a-C3aR信号对成纤维细胞的调控作用是通过PI3K-AKT的活化实现的（1）流式细胞分选术分离WT小鼠或C3aR^-/-小鼠乳腺CAF细胞,并培养。（2）WT-CAF细胞加入小鼠重组C3a刺激培养,Western blot方法检测α-SMA表达水平。（3）WT小鼠来源CAF细胞加入小鼠重组C3a刺激培养48小时,ELISA方法检测细胞培养上清中TGF-β的水平。（4）C3a刺激WT或C3aR^-/-来源的小鼠CAF细胞,不同时相点收集蛋白,并用Western Blot方法检测其中AKT与p-AKT的表达情况（5）使用小鼠重组C3a、小鼠重组C3a+C3aR拮抗肽（C3aRA）、小鼠重组C3a+抗C3aR抗体（Hycult 14D4）或小鼠重组C3a+LY294002（PI3K抑制剂）刺激小鼠成纤维细胞,在不同时间收集蛋白,并用Western Blot方法检测其p-AKT和AKT的表达。（6）用Ly294002预处理的成纤维细胞后,再用小鼠重组C3a刺激成纤维细胞,通过ELISA方法检测细胞培养上清的TGF-β水平。4.肿瘤细胞来源C3促进乳腺癌肿瘤转移（1）使用ELISA方法筛选鉴定4T1-C3KO细胞系（2）将4T1或4T1-C3KO细胞分别原位接种到Balb/c小鼠第三乳腺脂肪垫中,观察肿瘤生长情况。（3）将4T1或4T1-C3KO细胞分别原位接种到裸鼠中,观察肿瘤生长。第28天处死小鼠,取肿瘤,比较肿瘤重量。（4）第28天比较两组小鼠肺部肿瘤转移灶数目。（5）体外培养4T1或4T1-C3KO细胞,CCK-8检测两种细胞体外增殖情况。5.C3aR可成为乳腺癌抗转移治疗新靶点（1）将Balb/c小鼠原位接种4T1细胞,称重,将小鼠分为两组,分别注射PBS,SB290157（C3aR antagonist;10mg/kg体重,每周两次）,观察肿瘤生长情况,28天后比较肿瘤重量。（2）对WT小鼠原位接种4T1细胞,称重,将小鼠分为两组,分别注射PBS,SB290157三氟盐（C3aRA;10mg/kg体重,每周两次）,接种28天,用印度墨汁灌注小鼠肺脏、固定,比较两组小鼠肺部肿瘤转移情况。（3）将6周龄PyMT小鼠称重,分为两组,分别注射PBS或C3aRA（10mg/Kg体重,2次/周）,16周龄比较两组小鼠肺部肿瘤转移情况。（4）在线数据库PROGgeneV2分析乳腺癌患者中,同时高表达C3AR1,PDGFA对乳腺癌预后生存影响。结果:1.补体C3a/C3aR缺失使小鼠乳腺癌肺转移降低（1）结果显示,敲除C3aR的小鼠,其原位接种的4T1乳腺癌肿瘤,其原位肿瘤的生长及大小与WT小鼠的肿瘤无明显差异。（2）敲除C3aR的小鼠,其原位肿瘤中的肿瘤细胞的Ki67⁺比例没有明显降低。（3）C3aR^-/-小鼠原位接种4T1肿瘤后,小鼠肺脏的肿瘤转移灶明显减少。（4）C3aR^-/-小鼠的4T1原位接种模型中,其原位肿瘤中CAF细胞（PDGFR⁺F4/80^-）占活细胞的比例与WT小鼠中没有明显差别。（5）C3aR^-/-小鼠中的CAF细胞所表达的CAF细胞表型与功能分子水平明显下降。（6）C3aR^-/-小鼠的CAF细胞促肿瘤细胞的功能（迁移,侵袭）减弱。（7）人乳腺癌肿瘤组织RNA-Seq（WWW.cbioportal.org）数据库中,C3的表达与CAF细胞的表型（acta2,FAP,PDGFRa）的表达水平呈正相关。2.补体C3a/C3aR信号调控CAF的促肿瘤转移的功能（1）C3aR^-/-小鼠肿瘤组织的基因表达谱与WT肿瘤组织有显著差异。与细胞外基质成分相关的基因在C3aR^-/-小鼠肿瘤中显著下调（2）4T1原位接种肿瘤组织中,CAF细胞表面表达C3aR。（3）C3a/C3aR信号不影响CAF细胞数量。（4）C3a/C3aR信号调节CAF细胞促4T1肿瘤肺转移的功能。3.C3a/C3aR信号对CAF活性的调控是通过活化PI3K-AKT信号通路实现的（1）C3a促进成纤维细胞表型分子及功能分子的表达;（2）C3a刺激后,发生AKT的磷酸化（3）阻断C3aR信号,小鼠重组C3a所致AKT的磷酸化受到抑制。（4）阻断PI3K-AKT信号,成纤维细胞所表达的功能分子下调。4.4T1肿瘤细胞来源的C3促进乳腺癌肿瘤转移（1）C3敲除的4T1肿瘤细胞在免疫正常小鼠中,抑制肿瘤的生长。（2）C3敲除的4T1肿瘤细胞在免疫缺陷鼠中,轻度抑制肿瘤的生长。（2）C3敲除的4T1肿瘤细胞明显减少小鼠肺部肿瘤转移灶的数量。（3）C3敲除的4T1肿瘤细胞体外增殖能力不变。5.C3aR成为控制乳腺癌转移的新靶点（1）4T1原位接种Balb/c小鼠模型中,给予C3aRA（C3aR antagonist）能够显著抑制小鼠肺脏中肿瘤转移灶的数量。（2）PYMT自发乳腺癌小鼠模型中,给予C3aRA（C3aR antagonist）能够显著抑制小鼠肺脏中肿瘤转移灶的数量。（3）数据库中分析乳腺癌病人中高表达C3aR1,PDGFA更容易发生转移,以及生存时间减少。结论:1.C3a-C3aR信号在CAFs中促进乳腺癌的转移2.C3a-C3aR信号通路通过激活PI3K-AKT信号通路,增强细胞前转移性细胞因子分泌和细胞外基质成分在CAFs中的表达。3.C3aR信号的遗传或药理阻断能有效抑制小鼠乳腺癌的肺转移。